+7 (495) 720-06-54
Пн-пт: с 9:00 до 21:00, сб-вс: 10:00-18:00
Мы принимаем он-лайн заказы 24 часа*
 

Aero beg: Добро дошли на Аеродром Никола Тесла Београд

0

Аэропорт Никола Тесла | Билеты в Белграда туда и обратно.

Забронируйте и купите дешевые билеты в Белград на прямые и транзитные рейсы на сайте Aerotur.aero в несколько кликов.

Общая информация об аэропорте Никола Тесла

Аэропорт Никола Тесла расположен рядом с городом Белград в Сербии. Международное написание названия аэропорта Никола Тесла — Nikola Tesla. Найти расположение аэропорта Никола Тесла на картах, можно по географическим координатам: широта 44.82, долгота 20.31. Уточнить информацию об аэропорте Никола Тесла можно на сайте http://www.beg.aero Длина взлетно-посадочной полосы 3 400 метров. Превышение взлетно-посадочной полосы 102 метров.

Индивидуальные идентификаторы аэропорта Никола Тесла

Код IATA аэропорта — BEG

Код IATA состоит из 3 букв, разрабатывается международной ассоциацией воздушного транспорта и используется авиакомпаниями и системами бронирования авиабилетов.

Код аэропорта Никола Тесла может быть введён в форму поиска дешевых авиабилетов на сайте Aerotur.aero.

Код ICAO аэропорта — LYBE. Код ICAO состоит из 4 букв: Первая буква — географический регион расположения аэропорта Никола Тесла Вторая буква — страна Сербия . Последние буквы — обозначение аэропорта.

Ближайшие аэропорты от Николы Теслы

IATA код аэропорта BJY , аэропорт Батайница, расстояние 14 км. IATA код аэропорта QBG , аэропорт Pancevo, расстояние 27 км. IATA код аэропорта QND , аэропорт Novi Sad, расстояние 73 км. IATA код аэропорта UZC , аэропорт Ponikve , расстояние 113 км.

Важная информация при вылетах из/в аэропорта Никола Тесла (Белград)

Обращаем Ваше внимание, что в авиабилетах всегда указывается местное время. Просим учитывать это. Местное время в городе Белград (Belgrade) : +2 GMT.

Свяжитесь с нами

Если у Вас возникли вопросы при подборе, бронировании или покупке дешевых авиабилетов, обратитесь в службу поддержки Aerotur.aero, написав на почту [email protected] По вопросам, связанным с вылетами из/в аэропорт Никола Тесла (Белград) пишите в онлайн чаты Telegram и Whats App.

Грузоперевозки

ГРУЗОВОЙ ТЕРМИНАЛ

Грузовой терминал аэропорта осуществляет услуги по обработке прибывающих/убывающих грузов с возможностью размещения и хранения на складах.

Грузовой терминал обеспечивает обработку всех видов груза, кроме опасного.

К отправке принимается груз массой от 0,1 до 100 кг.

ОТПРАВКА ГРУЗОВ

Для отправки груза необходимо:

Юридическим лицам обратиться в отдел по работе с договорами для заключения Договора оказания услуг по организации перевозки грузов воздушным транспортом с АО «АЭРОПОРТ «БЕГИШЕВО».

Контактные данные: 8(8552) 796-610, e-mail: [email protected]

Физическим лицам необходимо обратиться в следующие компании по оформлению груза:

  1.  ООО «ГроссАвиаКарго», г. Набережные Челны, ул. Гидростроителей 21, тел. (88552) 777 – 556. Контактное лицо — Ксения.
  2. ПСГ, г. Набережные Челны, ул. Хасана Туфана 12, офис 19/2,  тел. 8-967-360-88-66. Контактное лицо — Жанна.
  3. ООО «Латино Трейд», г. Набережные Челны, проспект Мусы Джалиля, дом 29/2, офис 319,   тел.8-904-660-39-00. Контактное лицо — Екатерина.

По всем интересующим Вас вопросам можно обратиться на грузовой терминал АО «АЭРОПОРТ «БЕГИШЕВО»

Контактные данные: 8(8552)796-836 (8.00-16.00), кроме выходных и праздничных

8(8552)796-753 (круглосуточно), e-mail: [email protected]

ОФОРМЛЕНИЕ ПРОПУСКОВ

Для прохода на грузовой терминал необходимо оформить разовый пропуск в бюро пропусков на КПП АО «АЭРОПОРТ «БЕГИШЕВО».

При себе необходимо иметь документ, удостоверяющий личность, (паспорт).

ОПЛАТА УСЛУГ

Оплата услуг на авиаперевозку грузов и дополнительных услуг (хранение груза), предоставляемых грузовым терминалом, осуществляется в соответствии с утвержденным Прейскурантом стоимости услуг грузового терминала, который размещен в разделе Прейскуранты.

Для оплаты необходимо обратиться в Бюро пропусков на КПП- в будние дни с 08:00 до 16:00.

В остальное время оплата производится в кассе аэровокзального комплекса.

Оплата услуг может быть произведена картой, наличным способом, безналичным платежом на расчётный счёт АО «АЭРОПОРТ «БЕГИШЕВО» (для юридических лиц).

РЕЖИМ РАБОТЫ ГРУЗОВОГО ТЕРМИНАЛА:

Круглосуточно

Пересмены: 19.45 — 20.00

Перерыв: нет

Мужская футболка COMPRESSPORT для триатлона POSTURAL AERO белая

Непревзойденная легкость и мягкость конструкции! Дизайн рукава обеспечивает свободу движений независимо от формы тела.

Его эластичное волокно не оказывает давления на трицепс и бицепс, независимо от их размера. Вентилируемая сетка отводит избыточное тепло и пот, свежесть и комфорт на протяжении всей дистанции. Инновационная карманная система для хранения аксессуаров.

Эта хорошо пропускающая воздух футболка для триатлона  — самая функциональная компрессионная одежда для профессиональных триатлетов, которые тренируются на грани лимитов.

Мужская футболка COMPRESSPORT для триатлона POSTURAL AERO белая

Легкость и мягкость

Бесшовный рисунок на ткани, разработанный по 3Dтермальным технологиям, выделяет футболку по мягкости и тонкости из всех спортивных изделий

Гладкая текстура помогает избежать дискомфорта в мышцах

Не удерживает влагу и остается мягкой и легкой до финишной прямой.

 

Оптимальный контроль температуры тела

3Dтермальные технологии позволяют поддерживать постоянную оптимальную температуру тела в холодную или теплую погоду

Микрофибры работают в интерактивном режиме On/Off и подстраиваются под Ваш индивидуальный ритм

Регулируя вентиляцию, специальная сетка избавляет от пота и защищает при торможении

Не удерживает влагу и остается легкой, как перышко при любых условиях

 

 Идеальная поддержка

Легкое компрессионное плетение на спине является надежной опорой для позвоночника даже при сильном утомлении

Благодаря эластичной текстуре и облегающему дизайну, этот компрессионный топ обеспечивает максимальную поддержку для мышц

ИНСТРУКЦИИ ПО УХОДУ:

Машинная стирка при 30 ° C

Не отбеливать

Не гладить

Не подвергать химической чистке

Не сушить в стиральной машине

* Элементы могут отличаться от фотографий.

Транспортное сообщение| Город Белград

Расстояние от Белграда до других городов:
Амстердам 1736 км
Афины 1043 км
Барселона 1982 км
Вена 600 км
Берлин 1229 км
Будапешт 369 км
Бухарест 614 км
Брюссель 1682 км
Цюрих 964 км
Франкфурт 1067 км
Стамбул 947 км
Копенгаген 1691 км
Лиссабон 3192 км
Лондон 2045 км
Любляна 528 км 
Mадрид 2580 км
Милан 1030 км
Мюнхен 947 км
Москва 2218 км
Ниш 235 км
Нови-Сад 74 км
Осло 2252 км

Париж 1788 км
Подгорица 450 км
Прага 883 км
Приштина 374 км
Рим 1281 км
Сараево 325 км
Сегедин 219 км
Скопье 440 км
София 379 км
Салоники 700 км
Стокгольм 2269 км
Суботица 178 км
Варшава 1044 км
Венеция 643 км
Вршац 84 км
Загреб 393 км

АВТО-МОТО СОЮЗ СЕРБИИ
Княгини Зорки, 58 (серб. : Кнегиње Зорке 58)
www.amss.rs

Железнодорожное сообщение
www.zeleznicesrbije.com
ул. Железничка, б/н (серб.: Железничка бб)
Беовоз
Компания ʺСербские железные дорогиʺ ( серб.: «Железнице Србије») — «Беовоз», ул. Неманина, 6 (серб.: Немањина 6)

Железнодорожный вокзал Белград-Главный, Савская площадь, 2 (серб.: Савски трг 2)

Городской общественный транспорт
Перевозку пассажиров по Белграду осуществляют:
ГСП ʺБелградʺ (автобусы, троллейбусы, трамваи) 
Частные автобусные компании 
Службы такси 
СП ʺЛастаʺ (городское и пригородное автобусное сообщение)
Беовоз (железнодорожные линии в черте города)
Экспресс миниавтобус
городское автотранспортное предприятие ʺБелградʺ
ул. Княгини Любицы, 29 (серб.: Кнегиње Љубице 29), www.gsp.rs
Пригородные пассажирские перевозки 
СП ʺЛастаʺ а.д. Белград осуществляет пригородные и внутригородские пассажирские перевозки.
Автотранспортная компания ʺЛастаʺ АД

Автомагистраль Белград-Ниш 4, www.lasta.rs
АВТОБУСНАЯ СТАНЦИЯ ʺЛАСТАʺ
ул. Железничка, 2 (серб.: Железничка 2)

Авиасообщение
АЭРОПОРТ ʺНИКОЛА ТЕСЛАʺ БЕЛГРАД
www.beg.aero
Аэропорт расположен в 18 км к западу от Белграда, недалеко от населенного пункта Сурчин. Связь с городом осуществляется по автомагистрали Белград-Загреб. Все больше крупных мировых авиакомпаний открывает регулярные авиарейсы до Белграда. 
Компания Аэродром ʺНикола Теслаʺ
Air Serbia
ул. Юрия Гагарина, 12, Нови-Белград (серб.: Јурија Гагарина 12, Нови Београд)

Речное сообщение
Портовая капитания Белград 
ул. Караджорджева, 6 (серб.: Карађорђева, 6)
Порт ʺБелградʺ
www.lukabeograd.com
ул. Жоржа Клемансо, 37 (серб.: Жоржа Клемансоа 37)
Пристань ʺСаваʺ

Пограничный пункт пропуска и Таможенный переход
ул. Караджордева, б/н (серб.: Карађорђева бб)

Белград Никола Тесла Аэропорт plc Формат электронной почты

Мы установили стандарт поиска писем

Нам доверяют более 8,5 миллионов пользователей и 95% из S&P 500.


Нам не с чего начать. Обыскивать Интернет круглосуточно — это не поможет.RocketReach дал нам отличное место для старта. Теперь у нашего рабочего процесса есть четкое направление — у нас есть процесс, который начинается с RocketReach и заканчивается огромными списками контактов для нашей команды продаж . .. это, вероятно, сэкономит Feedtrail около 3 месяцев работы с точки зрения сбора потенциальных клиентов. Мы можем отвлечь наше внимание на поиски клиента прямо сейчас!

Отлично подходит для составления списка потенциальных клиентов.Мне понравилась возможность определять личные электронные письма практически от любого человека в Интернете с помощью RocketReach. Недавно мне поручили проект, который рассматривал обязанности по связям с общественностью, партнерству и разъяснительной работе, и RocketReach не только связал меня с потенциальными людьми, но и позволил мне оптимизировать мой поисковый подход на основе местоположения, набора навыков и ключевого слова.

Брайан Рэй , Менеджер по продажам @ Google

До RocketReach мы обращались к людям через профессиональные сетевые сайты, такие как Linkedln. Но нам было неприятно ждать, пока люди примут наши запросы на подключение (если они вообще их примут), а отправка слишком дорога … это было серьезным ударом скорости в нашем рабочем процессе и источником бесконечного разочарования … Благодаря огромному количеству контактов, которые мы смогли найти с помощью RocketReach, платформа, вероятно, сэкономила нам почти пять лет ожидания.

Это лучшая и самая эффективная поисковая машина по электронной почте, которую я когда-либо использовал, и я пробовал несколько.Как по объему поисков, так и по количеству найденных точных писем, я считаю, что он превосходит другие. Еще мне нравится макет, он приятный на вид, более привлекательный и эффективный. Суть в том, что это был эффективный инструмент в моей работе как некоммерческой организации, обращающейся к руководству.

До RocketReach процесс поиска адресов электронной почты состоял из поиска в Интернете, опроса общих друзей или преследования в LinkedIn. Больше всего меня расстраивало то, как много времени все это занимало. Впервые я использовал RocketReach, когда понял, что принял правильное решение. Поиск писем для контактов превратился в одноразовый процесс, а не на неделю.

Поиск электронных писем для целевого охвата был вручную и занимал очень много времени. Когда я попробовал RocketReach и нашел бизнес-информацию о ключевых людях за считанные секунды с помощью простого и непрерывного процесса, меня зацепило! Инструмент сократил время на установление связи с новыми потенциальными клиентами почти на 90%.

Аэропорт Белграда имени Николы Теслы (BEG)

Услуги:
Технический анализ существующей инфраструктуры

  • Оценка фактических пропускных способностей всех основных элементов и подсистем инфраструктуры
  • Оценка прошлых программ капитального ремонта / капитальных затрат для всех элементов инфраструктуры
  • Соответствие всех основных элементов инфраструктуры и подсистем
  • Планирование операционных мощностей

Концептуальный план развития и план землепользования

  • Фаза генеральной планировки территории аэропорта в период концессии
  • Развитие перрона и анализ пропускной способности ВПП
  • Поэтапное развитие инженерных сетей и инфраструктуры

Концепция развития терминала

  • Анализ существующих терминальных мощностей
  • Поэтапное развитие терминала
  • Визуализации и изображения-видео

Оценка воздействия на окружающую среду

  • Соответствие всех основных элементов инфраструктуры и подсистем действующим национальным стандартам
  • Возможное влияние исправлений и корректирующих действий

Программа капитальных затрат

  • Капитальные затраты с учетом мощности для всех основных элементов и подсистем инфраструктуры
  • Определить потенциал для оптимизации планируемого определения размеров авиационной инфраструктуры
  • Производные входы для бизнес-плана и модели оценки активов

Цели:
Приватизация аэропорта Белграда состоялась в 2017 году. Вместе с сильным консорциумом у нас была роль технического советника на 2 этапах торгов. Процесс проектирования включал генеральный план / план развития на весь период концессии, а также планирование расширения и переоборудования пассажирских терминалов. В дополнение к реконструкции существующих терминалов 1 и 2, был спроектирован полностью новый терминал 3, отвечающий всем требованиям к проектной мощности 18 MAP. В итоге предложение было признано лучшим техническим предложением.

Авиабилеты Киев — Белград от 27 USD

UAH

Сербский красавчик со сложной историей. Ему пришлось сохранить архитектурные шедевры Габсбургов. А также его несгибаемый дух, который, мы уверены, вы полюбите.

Как двигаться

Чтобы быстро добраться до города, ищите автобус A1 . Он направляется в сторону площади Славия и останавливается возле железнодорожного вокзала. Билет будет стоить около 2,5 евро * и может быть приобретен у водителя.

Для комфортного передвижения по городу купите билет (0,6 евро * в билетной кассе, 1,2 евро * у водителя) или карту BusPlus . Последний должен пополняться и использоваться всей компанией.

Вы можете осмотреть город и окрестности на такси . Самыми популярными услугами такси являются Pink и Beogradski (посадка — 1,4 евро *, далее — 0,5 евро * за километр).

И не забывайте, что через столицу проходит самый длинный веломаршрут в Европе — 680 км красивых дорог.Арендовать двухколесного друга можно в магазине Markoni . Иностранцам часто требуется иметь паспорт и залог — обычно около 100 евро *. Цены от 1,5 евро * час, за 4,5 евро * можно кататься весь день, а вернуть только на следующее утро.

Что посмотреть

Начните исследование с крепости и парка Калемегдан рядом с ней. Весь комплекс представляет собой огромный форт в центре города, который несколько десятков раз разрушался и перестраивался.

Пройти по Бранковскому мосту через Сава . Здесь можно сравнить панорамы Старого города и Нового Белграда, а также прогуляться по Народному парку .

Рядом находится музей современного искусства с работами Марины Абрамович. Входной билет стоит около 6 евро *.

Увидеть Собор Святого Саввы Кстати, он вмещает одновременно 10 000 человек и выглядит очень помпезно.Оттуда направляйтесь в сторону Skadarlija Street . Это одна из самых богемных и старых улиц города. Здесь можно посидеть с бокалом вина и приятно поболтать.

А если вы оказались в городе в теплое время года, обязательно посетите «Белградское море». Ада Циганлия — огромный пляж со всеми пляжными принадлежностями.

Об искусстве:

Галерея Колаковича с бесплатным входом

Культурный центр КЦБ , главный культурный центр города

Artget Gallery , единственная в Белграде, специализирующаяся на фотографии

Арт-пространство U10 , организованное молодыми художниками города

Съесть

В городе настоящий культ мяса.Поэтому уличная еда — это в основном гамбургеры и котлеты. Сытный перекус обойдется примерно в 2 евро *, но за свои деньги вы получите максимум гастрономических впечатлений.

Однако мы рекомендуем обедать в местных тавернах. Вечером много музыкантов, рахи, национальных сладостей. Полноценный ужин на двоих обойдется от 15 евро *.

Исследуйте (что посмотреть за городом)

Суботица — красивый типичный европейский город на границе с Венгрией

Новый Сад — неоготический город на берегу Дуная

Будапешт — столица Венгрии и шанс посетить новую страну

Жильё

Здесь очень много очень бюджетных хостелов. Но это никак не повлияет на уровень сервиса. Так, например, вы можете снять комнату на одного всего за 8 евро *. Номер в отеле в центре города обойдется примерно в 28 евро *. Примерно столько же будет стоить целая квартира в центре столицы.

Забронировать рейс

Киев — Белград рейсов доступны на сайте SkyUp Airlines. Щелкните и выберите желаемую дату.

Также мы предоставляем возможность приобрести авиабилеты Киев — Белград в рассрочку.Лети сейчас, плати потом.

* Все цены в тексте указаны на дату публикации.

% PDF-1.3 % 993 0 объект > эндобдж xref 993 195 0000000016 00000 н. 0000004253 00000 п. 0000004472 00000 н. 0000004503 00000 н. 0000004558 00000 н. 0000006583 00000 н. 0000006903 00000 н. 0000006971 00000 н. 0000007158 00000 н. 0000007316 00000 н. 0000007502 00000 н. 0000007670 00000 н. 0000007764 00000 н. 0000007948 00000 н. 0000008105 00000 н. 0000008181 00000 п. 0000008298 00000 н. 0000008399 00000 н. 0000008594 00000 н. 0000008786 00000 н. 0000009000 00000 н. 0000009211 00000 п. 0000009419 00000 п. 0000009630 00000 н. 0000009818 00000 н. 0000009986 00000 н. 0000010132 00000 п. 0000010284 00000 п. 0000010416 00000 п. 0000010544 00000 п. 0000010650 00000 п. 0000010807 00000 п. 0000010908 00000 п. 0000011005 00000 п. 0000011148 00000 п. 0000011268 00000 п. 0000011444 00000 п. 0000011599 00000 п. 0000011775 00000 п. 0000011882 00000 п. 0000011988 00000 п. 0000012095 00000 п. 0000012202 00000 п. 0000012318 00000 п. 0000012427 00000 п. 0000012534 00000 п. 0000012640 00000 п. 0000012747 00000 п. 0000012853 00000 п. 0000012960 00000 п. 0000013083 00000 п. 0000013245 00000 п. 0000013358 00000 п. 0000013529 00000 п. 0000013709 00000 п. 0000013848 00000 п. 0000014007 00000 п. 0000014194 00000 п. 0000014388 00000 п. 0000014582 00000 п. 0000014760 00000 п. 0000014872 00000 п. 0000015006 00000 п. 0000015120 00000 п. 0000015235 00000 п. 0000015360 00000 п. 0000015492 00000 п. 0000015605 00000 п. 0000015720 00000 п. 0000015838 00000 п. 0000015972 00000 п. 0000016086 00000 п. 0000016211 00000 п. 0000016343 00000 п. 0000016456 00000 п. 0000016563 00000 п. 0000016680 00000 п. 0000016814 00000 п. 0000016928 00000 п. 0000017039 00000 п. 0000017149 00000 п. 0000017258 00000 п. 0000017386 00000 п. 0000017608 00000 п. 0000017747 00000 п. 0000017933 00000 п. 0000018101 00000 п. 0000018236 00000 п. 0000018345 00000 п. 0000018430 00000 п. 0000018536 00000 п. 0000018643 00000 п. 0000018750 00000 п. 0000018856 00000 п. 0000018962 00000 п. 0000019069 00000 п. 0000019176 00000 п. 0000019282 00000 п. 0000019388 00000 п. 0000019495 00000 п. 0000019605 00000 п. 0000019713 00000 п. 0000019868 00000 п. 0000019975 00000 п. 0000020084 00000 н. 0000020190 00000 п. 0000020297 00000 п. 0000020404 00000 п. 0000020511 00000 п. 0000020617 00000 п. 0000020724 00000 п. 0000020831 00000 н. 0000020938 00000 п. 0000021044 00000 п. 0000021151 00000 п. 0000021257 00000 п. 0000021364 00000 н. 0000021510 00000 п. 0000021675 00000 п. 0000021842 00000 п. 0000021968 00000 п. 0000022141 00000 п. 0000022310 00000 п. 0000022484 00000 п. 0000022676 00000 п. 0000022819 00000 п. 0000022933 00000 п. 0000023125 00000 п. 0000023317 00000 п. 0000023475 00000 п. 0000023651 00000 п. 0000023843 00000 п. 0000023985 00000 п. 0000024099 00000 п. 0000024275 00000 п. 0000024373 00000 п. 0000024515 00000 п. 0000024710 00000 п. 0000024902 00000 н. 0000025111 00000 п. 0000025278 00000 н. 0000025453 00000 п. 0000025644 00000 п. 0000025745 00000 п. 0000025906 00000 п. 0000026099 00000 н. 0000026241 00000 п. 0000026355 00000 п. 0000026547 00000 п. 0000026741 00000 п. 0000026949 00000 п. 0000027063 00000 п. 0000027271 00000 п. 0000027478 00000 п. 0000027578 00000 п. 0000027696 00000 п. 0000027814 00000 п. 0000027932 00000 н. 0000028050 00000 п. 0000028169 00000 п. 0000028288 00000 п. 0000028407 00000 п. 0000028526 00000 п. 0000028645 00000 п. 0000028764 00000 п. 0000028883 00000 п. 0000029002 00000 п. 0000029121 00000 п. 0000029240 00000 п. 0000029359 00000 п. 0000029478 00000 п. 0000029704 00000 п. 0000029927 00000 н. 0000030463 00000 п. 0000030994 00000 п. 0000031244 00000 п. 0000031287 00000 п. 0000031358 00000 п. 0000031418 00000 п. 0000032551 00000 п. 0000032796 00000 п. 0000032880 00000 п. 0000033189 00000 п. 0000033311 00000 п. 0000033972 00000 п. 0000034205 00000 п. 0000034450 00000 п. 0000035375 00000 п. 0000036267 00000 п. 0000036347 00000 п. 0000039026 00000 н. 0000044646 00000 п. 0000064485 00000 н. 0000004599 00000 н. 0000006559 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 994 0 объект > эндобдж 995 0 объект [ 996 0 руб. ] эндобдж 996 0 объект > / F 3 0 R >> эндобдж 997 0 объект > эндобдж 1186 0 объект > ручей H PSW {/ G $ k

MOOC: Введение в авиационную технику

Видео курса

Вы когда-нибудь летали на самолете, и вам интересно, как это работает? Вас интересуют фундаментальные концепции полета? Как крыло создает подъемную силу? И как мы можем летать максимально оптимально?

Этот курс представляет собой введение в основы воздухоплавания с использованием экскурсии по истории полетов, начиная с полетов на воздушном шаре и кончая самолетами и вертолетами.

Эксперты факультета аэрокосмической техники Делфтского технологического университета помогут вам изучить и открыть для себя основы полета в трех блоках. Во-первых, вы изучите историю полетов, включая полеты на воздушном шаре, и получите базовое представление о самолетах и ​​атмосфере Земли. Темы включают устойчивость, навигацию, силовые установки и конструкцию самолета. Второй блок исследует принципы аэродинамики. Вы узнаете, например, как форма аэродинамического профиля или крыла влияет на величину создаваемой подъемной силы.В третьем блоке описывается механика полета, включая различные фазы полета, такие как снижение, подъем или крейсерский полет, а также наиболее оптимальные условия полета для каждой фазы.

Что вы узнаете

  • Влияние истории полетов на современные самолеты.
  • Как можно смоделировать земную атмосферу и как мы можем использовать это для проектирования самолетов.
  • Устойчивость, конструкции, навигация и движение самолета.
  • Основные аэродинамические концепции полета самолета.
  • Как аэродинамические поверхности и крылья создают подъемную силу.
  • Летная механика самолетов.
  • Как самолет может оптимально набирать, снижаться и совершать крейсерский полет.

Начните курс в любое время и завершите его в удобном для вас темпе!

Подробнее о коротких онлайн-курсах для профессионалов в области авиакосмической промышленности TU Delft.

Обзор курса, сделанный Дэном Флатом, математиком из колледжа Макалестер в Миннесоте:

«В мире должно быть очень мало продуктов, которые люди могут получить бесплатно, но они все равно просят платить! инженерный MOOC должен быть неплохим продуктом! И это соответствует моему опыту до сих пор.Я не могу поверить, насколько мне нравится этот курс. Если я не буду осторожен, этот курс может помешать моей работе! Вместо того, чтобы запрашивать подтвержденный сертификат для этого курса, я бы предпочел попросить следующий курс в следующем году. Поздравляем и благодарим разработчиков курса! »

Лицензия

Если не указано иное, Материалы курса принадлежат Технологическому университету Делфта и находятся под лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 Международная лицензия.


Авиационная погода, VAC и NOTAM для аэропорта Белграда (LYBE-BEG)

Авиационные наблюдения за текущей погодой и краткосрочный прогноз для пилотов, подготовка к полету с помощью METAR (сводка метеорологического аэродрома: текущая сводка погоды) и TAF (терминал Aerodrome Forecast: сообщение о краткосрочном прогнозе погоды для авиации. И другие ресурсы, такие как VAC (карта визуального захода на посадку) и NOTAM (уведомление пилоту) для подготовки полетов.

Карта визуального захода на посадку (карта визуального захода на посадку VAC) предоставляется без какой-либо гарантии ее своевременности.Пилот является единственным лицом, ответственным за проверку его действительности, прежде чем использовать его в оперативных целях для подготовки полета или использования во время навигации.

НОТАМ предоставляются без гарантии их актуальности. Пилот является единственным лицом, ответственным за проверку его действительности, прежде чем использовать его в оперативных целях для подготовки полета или использования во время навигации.

NOTAM Пожаротушение и спасение / действует со среды 28 июля 2021 года с 05:15 до среды 28 июля 2021 года в 07:35
A4394 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QFFCH / IV / NBO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107280515 C) 2107280735

E) AD FIRE AND RESCUE CAT ОБНОВЛЕНО ДО 9.

СОЗДАНО: 27 июля 2021 г., 15:20:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Огни центральной линии РД / действительно со вторника 27 июля 2021 г. с 13:24 по субботу 31 июля 2021 г. в 06:00
A4392 / 21 NOTAMR A4303 / 21

Q) LYBA / QLXAS / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107271324 C) 2107310600

E) TWY H CL LGT BTN ACFT STAND B2 AND B3 U / S ИЗ-ЗА WIP.

СОЗДАНО: 27 июля 2021 13:24:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Огни центральной линии РД / действительно со вторника 27 июля 2021 года с 13:23 по четверг 29 июля 2021 года в 06:00
A4391 / 21 NOTAMR A4302 / 21

Q) LYBA / QLXAS / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107271323 C) 21072

E) TWY J CL LGT U / S ИЗ-ЗА WIP.

СОЗДАНО: 27 июля 2021 13:24:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM РД / действительны со вторника 27 июля 2021 года с 13:23 по четверг 29 июля 2021 года в 06:00
A4390 / 21 NOTAMR A4301 / 21

Q) LYBA / QMXLT / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107271323 C) 21072

E) Левый и правый поворот FM TWY GITTED NOT PUE ПРОИЗВОДИТЬ.

СОЗДАНО: 27 июля 2021 13:23:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM РД / действительны со вторника 27 июля 2021 года с 13:22 по четверг 29 июля 2021 года в 06:00
A4389 / 21 NOTAMR A4300 / 21

Q) LYBA / QMXLC / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107271322 C) 21072

E) TWY J CLSD DUE TO WIP.

СОЗДАНО: 27 июл 2021 13:23:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM РД / действительны со вторника 27 июля 2021 года с 13:21 по четверг 29 июля 2021 года в 06:00
A4388 / 21 NOTAMR A4299 / 21

Q) LYBA / QMXLC / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107271321 C) 21072

E) ЧАСТЬ TWYH BTN ACFT STAND B1 И B4 CLSD WIP.

СОЗДАНО: 27 июл 2021 13:22:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Препятствие / действует со вторника 27 июля 2021 года с 13:01 до понедельника 27 сентября 2021 года в 21:50
A4387 / 21 NOTAMR A2690 / 21

Q) LYBA / QOBCE / IV / M / AE / 000/010 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107271301 C) 2109272150 EST

E) УСТРАНЕНИЕ ВРЕМЕННЫХ ПРЕПЯТСТВИЙ

ТИП CRANES

CRANES

HGT: 35M AGL

МЕСТО: ПЕРЕМЕН PSN FM ACFT STAND A1 НА A4

СОЗДАН: 27 июля 2021 г., 13:02:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Система посадки по приборам / действительно с понедельника 26 июля 2021 г. в 23: 34 до четверга 30 сентября 2021 года в 04:00
A4317 / 21 NOTAMR A4272 / 21

Q) LYBA / QICXX / I / NBO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107252334 C) 2109300400 EST

E) ВПП 12 ILS CAT III СНИЖЕНА ДО ILS CAT I

СОЗДАНО: 25 июля 2021 г. 23:34:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM РД ( s) / действует с 06:00 четверга 29 июля 2021 г. до 06:00 субботы 31 июля 2021 г.
A4305 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QMXLC / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A ) LYBE B) 21072

C) 2107310600 EST

E) ЧАСТЬ TWY H BTN ACFT СТЕНД B2 И B4 CLSD ИЗ-ЗА WIP.

СОЗДАНО: 23 июля 2021, 14:14:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Стойки самолетов / действительны с пятницы 23 июля 2021 года с 14:12 по субботу 31 июля 2021 года в 06:00
A4304 / 21 NOTAMR A3746 / 21

Q) LYBA / QMPXX / IV / BO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107231412 C) 2107310600 EST

E) НАЖМИТЕ НАЗАД FM ACFT STAND B4 ‘FACING NORTH’ D .

СОЗДАНО: 23 июля 2021, 14:13:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Стойки для самолетов / действительны с пятницы 23 июля 2021 года с 14:00 до субботы 31 июля 2021 года в 06:00
A4298 / 21 NOTAMR A3740 / 21

Q) LYBA / QMPLT / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2107231400 C) 2107310600 EST

E) ACFT STAND B1 LTD ДЛЯ ДОСТИЖЕНИЯ МАКСИМАЛЬНОГО РАЗМЕРА КРЫЛА ДО 24 МЕСЯЦЕВ ИЗ-ЗА WIP .

СОЗДАНО: 23 июля 2021 г., 14:00:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Взлетно-посадочная полоса / действует с понедельника 2 августа 2021 года в 23:10 по понедельник 2 августа 2021 года в 02:45
A4296 / 21 NOTAMN

Q ) LYBA / QMRLC / IV / NBO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2108012310 C) 2108020245

E) RWY 12/30 CLSD EXC EMERG LDG из-за WIP.

СОЗДАНО: 23 июля 2021 13:01:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Система стыковки / действует с понедельника 19 июля 2021 года с 12:07 до понедельника 18 октября 2021 года в 21:50
A4121 / 21 NOTAMR A1851 / 21

Q) LYBA / QFDXX / I / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 21071 C) 2110182150 EST

E) ВИЗУАЛЬНАЯ СИСТЕМА УКАЗАНИЯ ПО ДОКУМЕНТУ НА ACFT STANDEMOR 9000 A6 TO A6 СЛУЖБЫ.СЛЕДУЙТЕ ТОЛЬКО ИНСТРУКЦИЯМ MARSHALLER.

СОЗДАНО: 19 июля 2021 г., 12:07:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM для полетов по GNSS / действителен с четверга 12 августа 2021 г. в 00:00
A3822 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QGAXX / I / BO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2108120000 C) PERM

E) В ТАБЛИЦЕ КОДИРОВКИ ИЗМЕНИТЬ КОД

WPT BE498 ПРОЧИТАТЬ 443107.4N SUP 0202918.8E

REF , СТРАНИЦА 4.

СОЗДАНО: 07 июл 2021 08:41:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM GNSS для полетов для конкретных аэродромов / действует с четверга 12 августа 2021 года с 00:00 до четверга 26 августа 2021 года в 23: 59
A3727 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QGATT / I / BO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2108120000 C) 2108252359

E) TRIGGER NOTAM — AIRAC WEF 12 SUP 5/5 21 августа.

ВВЕДЕНИЕ ПРОЦЕДУРЫ TRIAL RNP AR APCH.

СОЗДАНО: 01 июля 2021, 14:39:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Самолеты стоят / действительны с четверга 17 июня 2021 года в 14:11
A3399 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QMPCS / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106171411 C) PERM

E) НОВЫЙ ФАРТУК E. ВВЕДЕНИЕ:

1. ПОДСТАВКА ACFT E1: МАКСИМАЛЬНЫЙ РАЗЪЕМ КРЫЛА 36,00M, КОНТРОЛЬНОЕ ТОЧЕК INS

7325

04817325

,

2.ПОДСТАВКА ACFT E2: МАКСИМАЛЬНЫЙ РАЗМЕТ КРЫЛА 36,00M, КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА INS

444856.33N 0201730.84E,

3. ПОДСТАВКА ACFT E3: МАКСИМАЛЬНЫЙ РАЗМЕТ КРЫЛА 36,00M, КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА INS

444854.88N 0201729.55E.

ПРИМЕЧАНИЕ. ДО ПУБЛИКАЦИИ В AIP ГРАФИЧЕСКАЯ ПРЕЗЕНТАЦИЯ ЯВЛЯЕТСЯ AVBL по номеру

ВЕБ-САЙТ: WWW.BEG.AERO

ВНИМАНИЕ: ТАКСИ ИСПОЛЬЗУЕТ МОЩНОСТЬ MNM, ЧТОБЫ СНИЗИТЬ ВЗРЫВ

.

СОЗДАНО: 17 июня 2021, 14:12:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Фартук / действителен с четверга 17 июня 2021 года в 14:07
A3398 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QMNCS / IV / B / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106171407 C) PERM

E) НОВЫЙ Фартук E СО СТЕНДАМИ ACFT E1, E2 и E3, УСТАНОВЛЕННЫЙ ПРОТИВОПОЛОЖЕНИЕМ

ОБЩИХ АВИАЦИОННЫХ БУТОНОВ С ДВУСТОРОННИМИ ДВУСТОРОННИМИ БУМАГАМИ .

ФАРТУК E — PCN 74 / R / B / W / T CONC.

ИСПОЛЬЗУЙТЕ TWY G, ЧТОБЫ ДОСТУПИТЬ К СТЕНДАМ ACFT E1, E2 И E3, ПОДОЖДИТЕ СЛЕДУЮЩИЕ ЗА МНЕ

НА СТОП-БАР.

ПОСЛЕДУЮЩИЕ МНЕ УКАЗАНИЯ К ФАРТУКУ E.

СИСТЕМА ВИЗУАЛЬНЫХ ДОКУМЕНТОВ НЕ AVBL.

СОЗДАНО: 17 июн 2021 14:08:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Процедура захода на посадку по приборам / действительна с четверга 17 июня 2021 года в 00:00
A3330 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QPICH / I / NBO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106170000 C) PERM

E) ИЗМЕНИТЬ ПОДШИПНИК ФОРМИРОВАНИЯ FAF И MAPT FIX

ЗНАЧЕНИЕ 122.44 ГРАДУСОВ BGD VOR ДЛЯ ЧТЕНИЯ 117,44 ГРАДУСОВ BGD VOR.

REF AIP AD 2 LYBE 6.4-6

СОЗДАНО: 16 июня 2021 г. 11:35:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Стойки для самолетов / действительно со среды 16 июня 2021 г. с 16:00 до субботы 16 октября 2021 г. в 22:00
A3293 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QMPCS / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106161600 C) 2110152200 EST

E) NEW TEMPO ACFT STANDS NC, И N2C ПРЕДНАЗНАЧЕН НА БАРТОНЕ №

FOLLOW FOLLOW ME VEHICLE FM СТОП-БАР B ИЛИ ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ УДЕРЖАНИЕ

ПОЛОЖЕНИЕ A1, ЗАТЕМ ИНСТРУКЦИИ MARSHALLER ПО ПАРКОВКЕ НА ПОДСТАВКАХ

ACFT.

НАЗАД СТЕНДЫ FM ACFT ОБЯЗАТЕЛЬНЫ ИЗ-ЗА WIP.

СОЗДАНО: 15 июн 2021 09:53:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Фартук / действителен со среды 16 июня 2021 года с 16:00 до субботы 16 октября 2021 года в 22:00
A3292 / 21 NOTAMN

Q ) LYBA / QMNXX / IV / BO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106161600 C) 2110152200 EST

E) APRON N — ОБЛАСТЬ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ОПЕРАТОРА РЕКЛАМЫ.

СОЗДАНО: 15 июн 2021 09:48:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM РД / действительны со вторника 15 июня 2021 года в 08:57 по субботу 16 октября 2021 года в 23:59
A3290 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QMXLC / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106150857 C) 2110152359 EST

E) ЧАСТЬ TWY F BTN СТОПОРНАЯ ПАНЕЛЬ F4 И F6 CLSD.

СОЗДАНО: 15 июн 2021 08:57:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM РД / действительны со вторника 15 июня 2021 года в 08:54 по субботу 16 октября 2021 года в 23:59
A3289 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QMXLC / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106150854 C) 2110152359 EST

E) TWY FA И TWY FB CLSD ИЗ-ЗА WIP.

СОЗДАНО: 15 июня 2021 года, 08:55:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Огни центральной линии РД / действительно со вторника 15 июня 2021 года в 08:52 по субботу 16 октября 2021 года в 23:59
A3288 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QLXAS / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106150852 C) 2110152359 EST

E) ФОНАРЬ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЛИНИИ ДВОЙНЫМ НА ФАЙДЕ NU / S.

СОЗДАНО: 15 июн 2021 08:53:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Самолеты стоят / действительны с понедельника 24 мая 2021 года в 06:36 по понедельник 23 августа 2021 года в 21:50
A2740 / 21 NOTAMR A1209 / 21

Q) LYBA / QMPLT / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105240636 C) 2108232150 EST

E) МАКСИМАЛЬНАЯ ДЛИНА ACFT ДЛЯ СТЕНДОВ ACFT A2, A3 и A4 ДО 27,2 М.

СОЗДАНО: 24 мая 2021 г., 06:37:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Система стыковки / действует с понедельника 24 мая 2021 года в 06:34 по понедельник 23 августа 2021 года в 21:50
A2739 / 21 NOTAMR A1210 / 21

Q) LYBA / QFDXX / I / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105240634 C) 2108232150 EST

E) ВИЗУАЛЬНАЯ СИСТЕМА УКАЗАНИЯ ПО ДОКУМЕНТУ НА ACFT STAND A2, A3 И A4 U С.

СОБЛЮДАЙТЕ ТОЛЬКО ИНСТРУКЦИИ MARSHALLER.

СОЗДАНО: 24 мая 2021 г., 06:35:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Aerodrome / действителен с понедельника 17 мая 2021 года в 10:12 по понедельник 16 августа 2021 года в 21:50
A2515 / 21 NOTAMR A0680 / 21

Q) LYBA / QFALT / IV / NBO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105171012 C) 2108162150 EST

E) AD CLSD ДЛЯ ACFT С КОДОМ F.

9000 174 May CREATED 2021 10:12:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Стойки для самолетов / действительны с 12:00 пятницы 7 мая 2021 г. до 12:00 субботы 7 августа 2021 г.
A2308 / 21 NOTAMN

Q) LYBA / QMPLT / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105071200 C) 2108071200 EST

E) МАКСИМАЛЬНАЯ ДЛИНА ACFT ДЛЯ ПОДСТАВКИ ACFT C7, C8, C9 И C10 ДО 27.16М.

СОЗДАНО: 07 мая 2021, 11:42:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Система стыковки / действует со среды 5 мая 2021 года с 12:24 по четверг 5 августа 2021 года в 21:50
A2283 / 21 NOTAMR A0436 / 21

Q) LYBA / QFDXX / I / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105051224 C) 2108052150 EST

E) ВИЗУАЛЬНАЯ СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ ДОК-СТАНДОМ ACFT STAND C6 U / S.

СОБЛЮДАЙТЕ ТОЛЬКО ИНСТРУКЦИИ MARSHALLER.

СОЗДАНО: 05 мая 2021 12:25:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

Стратификация бактериальных ландшафтов фитнеса на основе протеомного распределения, связанного с дискретными аэротипами

Abstract

Фитнес-ландшафт — это концепция, обычно используемая для описания эволюции к оптимальные фенотипы.Его можно свести к механистическим деталям, используя модели в масштабе генома (GEM) из системной биологии. Мы используем недавно разработанные GEM-модели метаболизма и экспрессии белка (ME-модели) для изучения распределения фенотипов Escherichia coli на плоскости скорость-выход. Мы обнаружили, что измеренные фенотипы распределяются неравномерно, образуя сильно стратифицированный ландшафт приспособленности. Системный анализ симуляций ME-модели предполагает, что эта стратификация является результатом дискретных стратегий генерации АТФ.Соответственно, мы определяем «аэротипы», фенотипический признак, который характеризует, как сбалансированный протеом может достичь заданной скорости роста путем модуляции 1) относительного использования путей окислительного фосфорилирования, гликолиза и ферментации; и 2) дифференциальное использование ферментов цепи переноса электронов. Эта глобальная, количественная и механистическая интерпретация системной биологии ландшафта приспособленности, сформированного при распределении протеома, предлагает фундаментальное понимание бактериальной физиологии и динамики эволюции.

Авторский обзор

Модели в масштабе генома позволяют количественно прогнозировать бактериальные фенотипы и детально описывать лежащее в основе оптимальное распределение протеома. Таким образом, теперь мы можем анализировать фенотипический потенциал большого количества генотипов Escherichia coli , выращенных в различных условиях, что приводит к обнаружению стратифицированного распределения фенотипов. Наблюдаемое распределение определяется различными стратегиями генерации АТФ, определяемыми как «аэротипы», связанными с оптимальным распределением протеома, модулируемыми при дифференциальном использовании ферментов транспортной цепи электронов.Этот механистический подход предлагает нам понимание ландшафта фитнеса на уровне генома и фундаментальную интерпретацию бактериальной физиологии и динамики эволюции.

Введение

Ландшафт пригодности Сьюэлла Райта [1] представлял собой раннюю попытку проиллюстрировать сложную взаимосвязь генотип-приспособленность в графической форме, которая позволяет легко концептуализировать эволюционную динамику. Технологические разработки в различных областях, включая мутагенез, эксперименты по эволюции микробов и высокопроизводительные методы секвенирования ДНК, теперь превратили эту концепцию из метафоры в реальные данные, позволяющие реконструировать эмпирические ландшафты приспособленности [2–4].Обычно изучаются два класса таких ландшафтов, чтобы изучить, как естественный отбор может привести популяцию к вершине пика приспособленности. Первый построен на основе дискретности белковых последовательностей, где эволюция моделируется как движение через промежуточные звенья эволюции по возможным мутационным путям. Это дискретное представление полезно для оценки вероятности эволюционных исходов [5] и демонстрации того, как молекулярные и эпистатические взаимодействия ограничивают количество доступных эволюционных путей [6–9].Однако экспериментальные исследования и последующее математическое моделирование ландшафта приспособленности ограничиваются хорошо охарактеризованным апостериорным отбором мутаций в изначально многомерном пространстве генотипов. Вторая модель определяет отношения фенотип-приспособленность в непрерывном и многомерном фенотипическом пространстве. Он способен адаптировать изменения в структуре ландшафта для многих видов и сред [10–12], но с ослабленной способностью связывать изменение приспособленности непосредственно с конкретным генетическим и молекулярным механизмом.

Эти хорошо изученные модели ландшафта приспособленности, дискретные или непрерывные, обращаются к эволюционной динамике в направлении оптимального фенотипа на основе редких полезных мутаций, которые возникают исторически или в ходе экспериментов по эволюции микробов [13]. Направленная эволюция ускоряет поиск полезных мутаций в многомерном пространстве последовательностей путем принудительного отбора желаемой функции и отбрасывания этих вариантов без улучшения. Этот мощный метод способен прояснить молекулярные механизмы адаптации и эволюционного компромисса в свойствах белков [14] в различных средах [15], что значительно обогатит наше понимание адаптивной траектории.Однако эффекты приспособленности для большинства мутаций, возникающих в природе, нейтральны, слегка вредны и немного полезны [16]. Распределение эффектов приспособленности этих спонтанных мутаций в естественных бактериальных популяциях остается неясным.

Альтернативный подход к изучению ландшафта приспособленности и фенотипического распределения исходит из пространства решений метаболической модели в масштабе генома (М-модель) [17, 18]. Модели в масштабе генома явно вычисляют, как оптимизация приспособленности организма на системном уровне достигается за счет естественной эволюции, с учетом ограничений на максимально возможное количество факторов.К ним относятся метаболическая нагрузка, распределение ресурсов и взаимодействия между геном и клеточной средой [19]. Способность моделей предсказывать фенотипы и быстро проверять миллионы генотипов позволяет исследовать изменения в оптимальном пространстве решений при делеции гена, обеспечивая ценную информацию о влиянии существенности гена [20] в различных условиях [21], пластичности и устойчивость метаболических сетей [22] и влияние эпистазных взаимодействий на распределение приспособленности [23, 24].

Расширение М-моделей с целью включения ограничений на стоимость биосинтеза белка повысило точность фенотипических прогнозов для различных организмов в различных средах [25–28]. Геномные модели метаболизма и экспрессии белка (ME-модели) для E. coli , в частности, явно включают полную реконструкцию путей транскрипции и трансляции, чтобы дать возможность количественного прогнозирования распределения протеома на уровне генов [29–2] 31] и способность предсказывать эволюционные исходы [32].Более поздняя разработка дополнительно учитывает зависящую от температуры каталитическую эффективность и термостабильность всех ферментов в ME-модели (FoldME-модель [33]), что позволяет четко сформулировать эффект мутации гена в отличие от прямого гена. удаление. Это последнее улучшение дает нам возможность оценить фенотипическое распределение естественных популяций E. coli в условиях фитнеса.

Здесь мы собираем и анализируем большие количества E.coli фенотипического роста в плоскости скорость-урожай и обнаруживают устойчивую неоднородность в распределении приспособленности. Фенотипы, определенные как с помощью вычислений, так и экспериментально, отображают несколько различных фенотипических категорий, которые распределяются полосами на уровне доходности и образуют ландшафт со «стратифицированной» топологией. Затем мы показываем с помощью подробного анализа метаболических потоков и экспрессии белков, что стратифицированная топография этого фенотипического ландшафта приспособленности может быть полностью описана стратегией производства энергии, которая, в свою очередь, определяется балансом между затратами на выделение протеома и метаболической эффективностью Производство АТФ.Интересно, что мы обнаружили, что простая величина — доля общего АТФ, которая генерируется АТФ-синтазой ( f ATPS ) — способна описать стратификацию. Следовательно, мы определяем E. coli «аэротипами» на основе мультимодального распределения f ATPS , модулированного посредством дискретного использования ферментов транспортной цепи электронов. Аэротип не только описывает дыхательное поведение клеток, но также указывает на соответствующее метаболическое состояние и протеомные композиции.Наконец, мы обсуждаем, как аэротип, как эффективный дескриптор пригодности, можно использовать для решения важных биологических вопросов, таких как предсказуемость микробной эволюции и интерпретация компромисса между нормой и урожайностью.

Результаты

Стратифицированная структура в ландшафте фенотипической приспособленности

E. coli , определенная на плоскости скорость-урожай

Мы использовали наиболее фундаментальные параметры роста бактерий, выход биомассы ( Y ) и скорость поглощения субстрата ( q ), чтобы охватить фенотипическое пространство для E.coli (Материалы и методы). Чтобы получить полное представление о распределении приспособленности, мы сначала составили сборник экспериментальных фенотипов роста из литературы, дополненной измерениями, полученными в наших экспериментах по адаптивной лабораторной эволюции (ALE) (материалы и методы и ссылки в них). Этот набор данных ( n = 199) включает характеристики различных встречающихся в природе штаммов E. coli , эволюционирующих мутантов с нокаутом генов и рост в различных питательных условиях.Сразу заметно, что регионы с высокой и низкой урожайностью густо заселены, но промежуточные области (0,2 < Y <0,3 gDW / g ) почти пусты (S1 Рис.).

Является ли наблюдаемое неравномерное распределение фенотипа скорости выхода результатом недостаточной выборки из экспериментальных данных или фундаментальным свойством, определяемым структурой генома и метаболической сети клетки? Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали модель FoldME [33] для расчета фенотипической пригодности для большого количества штаммов in silico, которые отбирают генетические вариации встречающегося в природе E.coli (Материалы и методы). Чтобы осуществить такой отбор штаммов, мы сначала выбрали гены для мутации в соответствии с рассчитанной частотой фиксированных мутаций для каждого гена (S2 фиг.). Затем мы определили молекулярный эффект выбранной мутации, варьируя каталитическую эффективность выбранного фермента ( k eff ) и термостабильность (Δ G ) на случайную, но небольшую величину (дополнительную информацию см. В разделе «Материалы и методы»). подробности). Наконец, рост отобранных штаммов моделировали в среде с минимальным содержанием глюкозы при колебаниях температуры от 25 ° C до 46 ° C, чтобы учесть влияние как генетических мутаций, так и изменений окружающей среды.

Рассчитанные эффекты пригодности для штаммов in silico были спроецированы на плоскость нормы урожайности. Контурная диаграмма всего 2200 отобранных образцов штаммов E. coli () хорошо подтверждает неравномерное распределение, наблюдаемое на основе экспериментальных данных. Что еще более важно, он предлагает характерное представление для «ландшафта фенотипической приспособленности», в котором фенотипы роста плотно группируются вдоль нескольких гиперболических линий на плоскости скорость-урожай (обозначены синими стрелками), но редко попадают между этими стратифицированными пиками плотности.

Мультимодальное распределение f ATPS определяет дискретное метаболическое состояние и стратификацию фенотипического ландшафта.

(A) Эффект пригодности, рассчитанный для 2200 in silico штаммов E. coli , демонстрирует стратифицированное распределение фенотипов на плоскости скорость-урожай. Синие стрелки указывают населенные районы, внутри которых распределение метаболических потоков остается относительно постоянным. Две изоклины μ выделены сплошными красными линиями.Цифры в незакрашенных кружках показывают расположение четырех штаммов in silico, выбранных для анализа метаболического потока, показанного на панели B. (B) Четыре репрезентативных метаболических состояния изображены распределением потоков основных путей в центральном метаболизме, включая путь гликолиза (метаболиты окрашен в зеленый цвет), окислительный пентозофосфатный путь (oxPPP, желтый) и цикл TCA (черный). Ключевые метаболиты, указанные на рисунке: glc: глюкоза; g6p: D-глюкозо-6-фосфат; g3p: глицеральдегид-3-фосфат; f6p: D-фруктозо-6-фосфат; пир: пируват; 6pgc: 6-фосфо-D-глюконат; пеп: фосфоенолпируват.Рассчитанные потоки каждого состояния окрашены в логарифмическую шкалу. (C) Распределение вычисленного f ATPS , подогнанного к смеси четырех распределений Гаусса. Результат показывает четыре пика с центрами 0,37, 0,53, 0,64 и 0,71. Дополнительный пик виден при f ATPS = 0. Пики в мультимодальном распределении f ATPS сильно коррелируют с населенными областями на плоскости нормы урожайности, показанной синими стрелками на панель А.

Метаболическая локализация продукции АТФ стратифицирует ландшафт фенотипической приспособленности.

Чтобы объяснить наблюдаемую стратификацию в распределении фенотипов, мы сначала исследовали метаболические особенности, характеризующие моделируемые образцы в каждой населенной области на плоскости скорость-выход. Интересно, что решения вдоль густонаселенных гиперболических линий (синие стрелки на рисунке), где q и Y положительно коррелированы, имеют схожие черты в их распределении потоков в центральном метаболизме (S3 рис.).Напротив, образцы, расположенные вдоль линий постоянной скорости роста ( μ, -изоклины, красные сплошные линии), показывают устойчивые вариации метаболических состояний, которые коррелируют со сдвигами в фенотипе скорость-урожай.

В частности, по мере того, как Y уменьшается вдоль μ -изоклина, следующие изменения метаболического состояния могут быть идентифицированы с помощью анализа основных компонентов (и S3 фиг.): 1) количество АТФ, продуцируемого АТФ-синтазой, уменьшается; 2) поток через цикл трикарбоновой кислоты (ТСА) уменьшается; 3) общий поток через путь гликолиза увеличивается; 4) секреция ацетата увеличивается; и 5) общая сложность метаболизма, измеряемая количеством активных реакций, снижается.Мы проанализировали данные экспрессии 17 штаммов E. coli , эволюционировавших в среде с минимальной глюкозой при 37 ° C [34] и 42 ° C [35], и подтвердили первые два рассчитанных тренда с положительной корреляцией между Y и общая массовая доля генов, участвующих в цикле TCA и окислительном фосфорилировании (S4 фиг.).

Мы заметили, что изменение потока реакций производства энергии хорошо коррелирует со сдвигом метаболического состояния и фенотипической локализации. Таким образом, мы вычислили долю общего АТФ, продуцируемого восемью АТФ-продуцирующими реакциями: 1) производство АТФ с помощью АТФ-синтазы (ATPS4rpp) и реакций, катализируемых полифосфаткиназой (PPKr и PPK2r) при окислительном фосфорилировании; 2) реакции, катализируемые фосфоглицераткиназой (PGK) и пируваткиназой (PYK) в низшем пути гликолиза; 3) реакция, катализируемая ацетаткиназой (ACKr) при смешанной кислотной ферментации; 4) реакция, катализируемая сукцинил-КоА синтетазой (SUCOAS) в цикле TCA; и 5) реакция, катализируемая рибозо-фосфатдифосфокиназой (PRPPS) в биосинтезе нуклеотидов.Эти величины ( f ATPS , f PGK , f ACKr и т. Д.) Сформировали восьмиэлементный вектор, который мы использовали в качестве объясняющих переменных в пошаговой линейной регрессионный анализ. Результаты показали, что шесть фракций продукции АТФ могут объяснить 89,5% вариации фенотипического расстояния (Материалы и методы, S5 Рис.), Подтверждая предсказуемую взаимосвязь картирования между метаболическим состоянием продукции АТФ и фенотипом.

Среди этих фракций, продуцирующих АТФ, особое значение имеет f ATPS . Тот факт, что f ATPS положительно коррелирует с Y и отрицательно коррелирует с q glc при каждой конкретной скорости роста (S6 рис.), Определяет его как метаболическое происхождение наблюдаемой взаимосвязи. между метаболическим состоянием и фенотипом урожайности. Наблюдаемая корреляция в основном коренится в энергетической и метаболической сети клетки, а не является простой функцией экспрессии АТФ-синтазы (S7 рис.).Интересно, что f ATPS демонстрирует мультимодальное распределение, которое сильно коррелирует с распределением фенотипов скорости-урожайности. Решения с более высокими значениями f ATPS (например, со средними значениями 0,71 или 0,64) расположены в пределах двух верхних гиперболических диапазонов на плоскости доходности (). Для этих высокопродуктивных фенотипов доступны данные высокого разрешения 13 C-метаболического потока для экспериментальной оценки их значений f ATPS .Мы рассчитали, что f ATPS составляет ∼0,65 для E. coli MG1655 эволюционировало в среде с минимальной глюкозой и ∼0,706 для E. coli BL21 [36], оба значения находятся в пределах 1,5% от прогнозируемых пиковых значений. с помощью нашего моделирования.

Чтобы еще раз подтвердить критическую роль f ATPS , мы проверили, привела ли дискретность f ATPS непосредственно к стратифицированной структуре ландшафта фенотипической пригодности.Мы выполнили моделирование выборки деформации, где f ATPS был ограничен пятью прогнозируемыми пиковыми значениями: 0, 0,37, 0,53, 0,64 и 0,71 (материалы и методы). Результаты ясно показали, что оптимальные решения, полученные при конкретном f ATPS , были ограничены в пределах тонкой гиперболической полосы, где q и Y были положительно коррелированы (S8 (A) Рис.). При одинаковой подаче субстрата, чем выше f ATPS , тем выше выход биомассы, что согласуется с корреляциями, показанными на S6 (B) Рис.Этот реконструированный ландшафт приспособленности полностью воспроизводил наблюдаемое стратифицированное фенотипическое распределение.

Таким образом, мы ввели долю общего АТФ, продуцируемого АТФ-синтазой ( f ATPS ), как простую, но эффективную количественную оценку метаболического состояния клетки и ключевой определяющий фактор для стратифицированного фенотипического распределения. на плоскости нормы доходности.

Мультимодальное распределение

f ATPS ограничено протеомной сложностью путей продукции АТФ

Количественная взаимосвязь между f ATPS и метаболическим и фенотипическим состоянием клетки вдохновила на исследование лежащих в основе ограничения, накладываемые на реакции производства АТФ.Чтобы установить источник этого ограничения, мы ищем систематические различия в профилях экспрессии белка между растворами с разными значениями f ATPS . Во-первых, мы создали моделирование выборки, ограниченное шестью определенными скоростями роста при 30 ° C, чтобы ограничить неконтролируемые отклонения от температурных различий в скорости роста (Материалы и методы, S9 (A) Рис.). Результат подтвердил наблюдаемые взаимосвязи путем воспроизведения мультимодального распределения с центром в тех же значениях f ATPS (S9 (B), рис.).

Затем мы упорядочиваем профили экспрессии смоделированных штаммов по их вычисленным значениям f ATPS (). Мы обнаружили, что увеличение f ATPS сопровождается переходом к более сложному протеому. Увеличение сложности протеома проявляется двояко. Во-первых, количество экспрессируемых генов увеличивается (слева). Например, пентозофосфатный путь и мультигенные белковые комплексы в окислительном фосфорилировании широко используются только при включении аэробного дыхания ( f ATPS > 0).Во-вторых, увеличивается среднее количество субъединиц на фермент (справа). Другими словами, по мере того, как АТФ-синтаза становится ответственной за производство большей части АТФ, клетка имеет тенденцию использовать более крупные многодоменные белковые комплексы вместо моногенных ферментов с низкой молекулярной массой.

Мультимодальное распределение f ATPS определяется сложностью протеома.

(A) Смоделированные концентрации ферментов, показанные на панели C в 368 моделированиях выборки, упорядоченные по их вычисленным значениям f ATPS (толстая синяя сплошная линия).(B) Сложность протеома, измеренная по рассчитанному количеству экспрессируемых генов (слева) и среднему количеству субъединиц на фермент (справа) в оптимальном растворе. Оба числа увеличиваются по мере увеличения рассчитанного f ATPS . Данные представлены в виде прямоугольных диаграмм с центральной красной линией, показывающей медианное значение, нижний и верхний края указывают 25 и 75 процентили, соответственно, и усы, простирающиеся до 1.В 5 раз больше межквартильного размаха. Неперекрывающиеся отметки на прямоугольной диаграмме показывают, что медианы между группами различаются с достоверностью 95%. Количество образцов в каждом поле указано в скобках. (C) Молекулярная масса выбранных белков и белковых комплексов, катализирующих реакции в путях продуцирования АТФ.

Переключение между моногенными и мультидоменными ферментами является наиболее очевидным в путях окислительного фосфорилирования и, в частности, в реакциях цепи переноса электронов (ETC) ().Например, восстановление хинонового пула в основном выполняется NADH-дегидрогеназой II Ndh при низком уровне f ATPS , но переключается на более крупные белковые комплексы, такие как формиатдегидрогеназа и NADH: хиноноксидоредуктаза, как f ATPS увеличивается. В последующем окислении хинола и транспорте протонов через внутреннюю мембрану меньший оксидазный комплекс CydABX используется при низком уровне f ATPS , а более крупная альтернатива CyoABCD берет верх при более высоком уровне f ATPS .Мы отмечаем, что примерно 60% реакций окислительного фосфорилирования полагаются на один или несколько белковых комплексов для катализа (таблица S1). По сравнению с другими метаболическими путями, этот высокий уровень сложности белка, вероятно, является эволюционным результатом, обеспечивающим большую гибкость и тонкую настройку для дискретного выбора стратегий производства энергии.

Эти результаты показывают сложный баланс между сложностью протеома и потребностями в энергии для роста клеток. По мере увеличения потребности в энергии для достижения более высокого выхода АТФ необходимо все больше и больше ферментных комплексов.Однако более крупные комплексы также требуют значительно больше метаболических ресурсов для их биосинтеза. Таким образом, после активации эти ферментные комплексы должны использоваться в максимально возможной степени, вызывая необходимую перестройку метаболической сети для оптимального баланса в распределении протеома и сдвигая стратегию производства АТФ к следующему дискретному состоянию.

Введение «аэротипа» как фенотипического признака, определяемого на основе

f ATPS

Мы показали, что аэробное дыхание через АТФ-синтазу определяет метаболическое состояние клетки и ее фенотипическое положение в зависимости от скорости выхода. самолет.Соответственно, мы определяем «аэротипы» от i до v для описания пяти популяционных фенотипов, представленных пятью пиковыми значениями f ATPS (от f ATPS = от 0 до f ATPS ∼ 0,71), наблюдаемые при моделировании отбора проб деформации. Вычислительно мы сравниваем аэротип с отношением P / O, обычно используемым параметром, описывающим дыхательное поведение клеток. Мы показываем, что соотношение P / O описывает только локальную стехиометрию путей окислительного фосфорилирования.Аэротип предлагает более глобальное описание клеточной приспособленности, представляя метаболическое и фенотипическое состояние, а также сложность протеома, связанную с конкретной схемой производства энергии (S1 Text и S10 Fig). Тем не менее, необходимы экспериментальные данные, чтобы установить, что аэро-тип, определяемый с помощью вычислений, может служить практическим косвенным показателем приспособленности бактерий.

Мы обратились к характеристике генетических мутаций, которые могут вызвать переключение в аэротипе. В соответствии со всесторонним разложением использования фермента ETC, показанным на S10 и фиг. cyoB из оксидазы цитохрома bo и cydB из оксидазы цитохрома bd -I) для генетических манипуляций (Материалы и методы).Мы ожидаем, что удаление ndh , скорее всего, переключит ячейку на iv или v , которые имеют наивысший Y и самый низкий q glc на скорости — уступить самолет. Удаление cyoB (независимо от того, какая НАДН-дегидрогеназа присутствует), скорее всего, оставит клетку в аэротипе i и ii , с более низким Y и более высоким q glc .Мутанты, обедненные cydB и / или nuoB , в принципе все еще доступны для всех аэротипов. Однако мутант Δ nuoB с меньшей вероятностью будет иметь более высокий Y и более низкий q glc , поскольку NADH-дегидрогеназа I почти всегда активируется для iv и v аэродинамического типа. .

Мы построили одинарный (Δ ndh , Δ nuoB , Δ cydB и Δ cyoB ) и двойной (Δ ndh Δ cydB , Δ3 Δ nuoB Δ cydB и Δ nuoB Δ cyoB ), чтобы экспериментально проверить предсказанный фенотипический эффект (Материалы и методы).Характеристика фенотипа восьми мутантов качественно уловила предсказанные с помощью вычислений тенденции (и таблицу S2) и показала, что спланированное удаление генов ETC способно сдерживать мутант в пределах соответствующего аэротипа при различных температурах (S11 рис.). Дополнительные доказательства были получены от Portnoy et al. [37], где все концевые гены цитохромоксидазы ( cydAB , cyoABCD и appBC ) и ген хинолмонооксигеназы, ygiN , были удалены из E.coli геном. Этот мутантный штамм характеризовался самым низким возможным Y и самым высоким q glc , что соответствует аэро-типу i ( f ATPS = 0).

Экспериментальная характеристика аэротипа для штаммов, нокаутных по ETC-ферменту E. coli .

(A) Фенотипическая характеристика штаммов с одинарным и двойным нокаутом ETC на плоскости скорость-выход. Аэротипы присваиваются в соответствии с вычисляемой заштрихованной областью на плоскости нормы доходности.(B) Профили экспрессии мутантных штаммов показаны для центральных метаболических генов, участвующих в гликолизе, пируватном пути, пентозофосфатном пути, окислительном фосфорилировании, цикле TCA, метаболизме аминокислот и метаболизме нуклеотидов. Иерархическая кластеризация для мутантных штаммов показывает аналогичную классификацию аэротипа в зависимости от их местоположения на уровне урожайности. Обогащение генов в каждом кластере указано внизу.

Затем мы подтвердили корреляцию между аэротипом и протеомным состоянием мутантных штаммов с помощью анализа RNA-Seq (материалы и методы).Иерархическая кластеризация профиля экспрессии показала группировки, согласующиеся с аэротипом, назначенным на уровне доходности (). Например, мутанты Δ cyoB сгруппированы вместе в более низкий аэро-тип независимо от их большой разницы в скорости роста и скорости поглощения глюкозы. Гены, участвующие в центральном метаболизме, также были объединены в две основные группы (). В соответствии со сдвигом метаболического состояния, показанным на, аэробное дыхание и метаболическая активность уменьшаются, в то время как анаэробное дыхание увеличивается по мере того, как назначенный аэротип понижается с v (желтый) до ii (фиолетовый).

Короче говоря, мы разрабатываем мутантные штаммы, в которых основные ферменты ETC удаляются комбинаторно, чтобы нарушить дыхательный потенциал клетки и стратегию производства АТФ. Мы показываем, что фенотипический результат, перераспределение протеома и фенотипическое переключение аэротипа этих штаммов согласуются с расчетными прогнозами.

Стратификация анаэробных фенотипов с использованием нитратов в качестве акцептора электронов

В качестве факультативного анаэроба E. coli способна процветать в различных условиях окружающей среды, от очень токсичных до полностью бескислородных, с ее удивительно универсальным пулом из пятнадцати человек. первичные дегидрогеназы и десять концевых редуктаз [38].До сих пор мы обсуждали, как дифференциальное использование примерно одной трети этих ферментов приводит к стратифицированному фенотипическому распределению во время аэробного роста, когда кислород используется в качестве конечного акцептора электронов. Как оптимальные фенотипы распределяются на уровне урожайности в анаэробных условиях, если активируются альтернативные дегидрогеназы и терминальные редуктазы?

Чтобы ответить на этот вопрос, мы создали штамм in silico, в котором экспрессия всех концевых генов цитохромоксидазы ( cydAB , cyoABCD и appBC ) и гена хинолмонооксигеназы ( ygiN ) была установлена ​​на ноль. .Было показано, что этот мутантный штамм дает фенотип, который почти не способен использовать кислород и проявляет ферментативное поведение в условиях кислорода [37]. Учитывая, что нитрат подавляет другие анаэробные пути в E. coli в аноксических условиях [38], мы добавили нитрат, который будет использоваться в качестве предпочтительного акцептора электронов вместо кислорода, выполнили моделирование выборки штаммов и исследовали распределение приспособленности.

Было обнаружено три дискретных анаэробных фенотипа, которые стратифицированно распределялись на плоскости скорость-урожай ().В соответствии с анализом аэротипа каждый наблюдаемый фенотип может быть охарактеризован конкретным значением f ATPS (), использованием другой комбинации респираторных ферментов () и различной сложностью протеома (). По аналогии, но не путать с «аэротипом», где кислород используется в качестве концевого акцептора электронов, мы обозначили эти анаэробные фенотипы «нитро-типом» i iii . Нитро-тип и с самым низким выходом биомассы экспрессировал сирогем НАДН-нитритредуктазу NirAB в дополнение к высокой экспрессии нитратредуктазы A или Z.Этот низкомолекулярный фермент, вероятно, помог снизить сложность протеома либо за счет детоксикации нитрита, вырабатываемого нитратредуктазами, либо за счет ферментативной аммонификации, которая балансирует между максимизацией производства АТФ и поддержанием уровней NAD + [39]. Эти результаты еще раз подчеркнули важность распределения протеома для путей производства энергии в определении фенотипического распределения.

Стратифицированное фенотипическое распределение в анаэробных условиях с добавлением нитратов.

(A) Фитнес-эффект рассчитан на основе 550 in silico Штаммов E. coli анаэробно растут с использованием нитрата в качестве акцептора электронов. Три анаэробных респираторных состояния (нитро-тип iii в голубом, нитро-тип II в красном и нитро-тип i в темно-синем) можно четко идентифицировать на плоскости скорость-выход, которые распределяются в стратифицированной мода похожа на обвес. (B) Распределение рассчитанного f ATPS , показывающее три пика, коррелированных с тремя заселенными нитро-типами на плоскости нормы урожайности, показанной на панели A.(C) Моделируемые концентрации ферментов, участвующих в окислительном фосфорилировании, в 550 моделированиях выборки. Данные, показанные в третьем столбце, обозначенном «Nar», представляют собой сумму концентраций нитратредуктазы A и Z; а в четвертом столбце, обозначенном «Fdn / o», представлена ​​сумма концентраций формиатдегидрогеназы N и O. (D) Сложность протеома, измеренная расчетным количеством экспрессируемых белков (слева) и средним количеством субъединиц на фермент. (справа) в оптимальном решении.Данные представлены в виде прямоугольных диаграмм с центральной красной линией, показывающей медианное значение, нижний и верхний края указывают 25 и 75 процентили, а усы простираются в 1,5 раза больше межквартильного размаха. Неперекрывающиеся отметки на прямоугольной диаграмме показывают, что медианы между группами различаются с достоверностью 95%. Количество образцов в каждом поле указано в скобках. (E) Молекулярная масса белковых комплексов, показанная на панели C. Молекулярная масса, обозначенная «Nar», представляет собой среднее значение нитратредуктазы A и Z.Молекулярная масса, обозначенная «Fdn / o», представляет собой усредненное значение формиатдегидрогеназы N и O.

Обсуждение

В этом исследовании мы разрабатываем системно-биологическое определение ландшафта фенотипической пригодности на основе пространства решений E Модель FoldME в масштабе генома .coli [33]. Моделирование, в котором отбираются тысячи штаммов E. coli при различных температурах, приводит к открытию стратифицированной геометрии фенотипического распределения, которое согласуется с наблюдениями из сборника экспериментальных фенотипических данных.Способность FoldME выявлять количественные многоуровневые взаимосвязи между генотипом клетки, состоянием метаболизма, протеомным распределением, стратегией производства энергии и фенотипом дает нам возможность интерпретировать наблюдаемую топографию ландшафта фенотипической приспособленности [19, 40]. Мы обнаруживаем, что: 1) расслоение происходит из-за дискретности стратегии производства АТФ; 2) доля АТФ, продуцируемая АТФ-синтазой ( f ATPS ), является определяющим параметром, описывающим дискретизацию; и 3) дискретность основана на балансе между модульностью протеомного состава и метаболическими функциями, лежащими в основе оптимального роста.

Прямая корреляция между стратегией производства энергии клеткой и топографией фенотипического ландшафта вдохновляет определение E. coli «аэротип», чтобы суммировать сложные взаимосвязи между генотипом, метаболическим состоянием, распределением протеома и фенотипом. Мы полагаем, что переключение на аэротип может произойти, если дифференциальное использование ферментов ETC вызвано генетическими мутациями или стрессами окружающей среды. Чтобы подтвердить гипотезу, мы экспериментально конструируем мутантные штаммы, в которых основные ферменты ETC удаляются комбинаторно, и показываем, что измеренные аэротипы мутантов согласуются с расчетным предсказанием.

С аэротипом, определенным в качестве ключевого фенотипического дескриптора, стоит отметить, что дискретизация производства АТФ через другие реакции (представленные как f PGK , f PYK и f ACKr , S8 (B) –S8 (D) рис.) Внутри каждого аэротипа также наблюдается (S8 (B) –S8 (D) рис.). Основываясь на этих результатах, мы предлагаем многоуровневую регуляцию, которую клетка использует для корректировки своей стратегии производства энергии при адаптации к генетическим и экологическим нарушениям (S12 (A) Рис.).Клетка сначала делит свои клеточные ресурсы между АТФ-синтазой и ферментами, которые катализируют другие реакции производства АТФ, чтобы удовлетворить минимальную потребность в АТФ для роста. Таким образом определяется аэротип. Затем, в рамках каждого аэротипа, два типа реакций дополнительно регулируют соотношение между протеомом, предназначенным для производства АТФ и предшественника биомассы, соответственно: 1) те, которые производят как АТФ, так и предшественники биомассы, такие как PGK и PYK, и 2 ) ACKr, который способствует только производству АТФ.Конечный результат оптимизирует соотношение между АТФ и предшественниками биомассы, чтобы максимизировать производство биомассы при адаптации к конкретным условиям, с которыми сталкивается клетка.

Эта двухуровневая регуляция согласуется с основными физическими принципами компромисса дыхания и ферментации на верхнем уровне и термодинамического компромисса между биомассой и выходом АТФ на втором уровне [41, 42]. Более того, наша формулировка предлагает важные механистические детали по сравнению с аналогичными усилиями, которые моделируют энергетический метаболизм как разделение между параллельными путями продуцентов АТФ с высоким и низким выходом и продуцента биомассы [43, 44], поэтому расширяет объяснительную силу за пределы ограниченные границы на уровне доходности до полного диапазона фитнес-ландшафта.

Предлагаемая иерархическая стратегия производства энергии может найти применение в различных областях, таких как метаболическая биохимия, клеточная физиология и эволюционная динамика. Например, компромисс между нормой и урожайностью — один из давних вопросов в понимании физиологии бактерий [45], однако до сих пор существуют разногласия относительно того, следует ли рассматривать положительную или отрицательную взаимосвязь [46, 47]. Помимо того, что должно произойти в результате взаимосвязи, механистические интерпретации также могут иметь различные формы: компромисс между инвестициями в протеом между метаболическими ферментами и системой поглощения ограничивающего питательного вещества [48, 49], компромисс эффективности между ферментами ферментации и дыхания [50, 51] ], или компромисс между эффективностью мембраны и выходом АТФ [52], и это лишь некоторые из них.Наши результаты помогают выдвинуть обобщенное, но однозначное согласование этих различных точек зрения. Если стратегия производства энергии (или авиационная) останется прежней, должна наблюдаться положительная корреляция производительности и производительности. Когда текущий энергетический план не способен поддерживать рост и должен произойти переход на другой аэротип, возникает фенотипический компромисс.

Фенотипический ландшафт, определенный на основе аэротипа, также предлагает альтернативную перспективу для понимания бактериальной адаптации к оптимальной приспособленности.Вместо «восхождения на пик приспособленности» мутации, возникающие в процессе эволюции, могут двигать фенотип в двух направлениях: первое — в сторону более высокой скорости роста, выхода биомассы и скорости поглощения питательных веществ, при которой клетки остаются в том же аэротипе; а другой — в ортогональном направлении, где ожидается переключение аэродинамического типа при постоянной скорости роста. Эффект приспособленности конкретной мутации затем может быть проанализирован через ее влияние на метаболическую сеть и перераспределение протеома, которое регулируется фундаментальными физико-химическими принципами, касающимися компромиссов ферментации-дыхания и термодинамики.Мы представляем первоначальную попытку контекстуализировать эту точку зрения на бактериальную эволюционную динамику (текст S2 и S12 (B) и S12 (C) Рис) и ожидаем, что последующие исследования изучат, как эта структура может помочь нам понять конвергенцию и дивергенцию, предсказуемость и стохастичность. бактериальной эволюции.

Концепция фитнес-ландшафта формировала мышление в эволюционной биологии с 1930-х годов, когда она была впервые сформулирована. Здесь мы предлагаем низкоразмерное представление ландшафта фитнеса путем количественной оценки метаболического и протеомного состояния с использованием относительного вклада нескольких ключевых реакций, продуцирующих АТФ.Наш анализ показывает, что топология этого фитнес-ландшафта закодирована в стратегии распределения энергии, лежащей в основе метаболической сети организма и сложности протеома. Влияние колебаний окружающей среды (например, изменение температуры, наличие и отсутствие кислорода) и генетических нарушений (например, различных стратегий отбора проб на эффективность ферментов и стабильность белка) на ландшафт пригодности можно рационально оценить на основе того, как производится выработка энергии клеткой. регулируется.В принципе, такой ландшафт пригодности должен быть общей и эффективной структурой, с помощью которой можно понять адаптацию и эволюцию различных типов клеток в различных организмах (например, эффект Крэбтри для дрожжей и эффект Варбурга для раковых клеток) в различных условиях.

Материалы и методы

Справочник

фенотипов E. coli

Скорость и урожайность являются наиболее фундаментальными величинами, используемыми для описания бактериальной экологии и физиологии. Скорость может быть измерена как скорость роста или количество молей / граммов субстрата, АТФ или продукции биомассы в единицу времени.Урожай обычно измеряется в молях / граммах биомассы или АТФ на единицу субстрата. Независимо от того, какое определение нормы и урожайности использовать, эти два физиологических параметра тесно связаны друг с другом. Однако точная форма взаимосвязи зависит от контекста, который может варьироваться в зависимости от различных экспериментальных процедур и условий. Здесь мы стремимся разрешить противоречие и предоставить единое объяснение зависимой от условий корреляции между ставкой и доходностью. Следовательно, конкретное определение не должно влиять на наше исследование и обсуждение.Без потери общности и для сравнения с моделированием в масштабе генома с использованием глюкозы в качестве источника углерода мы решили использовать скорость поглощения субстрата (глюкозы) ( q ( q glc ), ммоль / гДВт / ч) и выход биомассы (гДМ / г) для обозначения фенотипического пространства E. coli .

Скорость поглощения субстрата ( q ) и скорость роста ( мк ) собираются из двух основных типов экспериментальных измерений (S1 (B) Рис, вверху слева): 1) рост в хемостате питательных веществ [27, 53–57 ], и 2) характеристика конечных штаммов ALE [32, 34, 35, 37, 58–64].Затем рассчитывается выход биомассы в мккв · м, где м — молекулярная масса субстрата. В общей сложности 199 точек данных дают фенотипическое пространство, охватываемое скоростью поглощения субстрата и выходом биомассы, включая измерения, проведенные для E. coli дикого типа и штаммов с нокаутом гена (S1 (B), рис., Вверху справа), при различных питательных веществах. условиях (S1 (B), рис., внизу слева), и с различными штаммами E. coli (S1 (B), рис., внизу справа). Несмотря на большое различие в источниках данных, фенотипическая характеристика E.coli , кажется, занимает общее пространство с интересной структурой, которая обсуждается в результатах.

Обзор модели FoldME

Все моделирование выборки в этой статье выполняется с использованием недавно разработанной модели в масштабе генома для метаболизма и экспрессии белков, усиленной шаперонной сетью FoldME [33]. Реконструкция FoldME началась с связывания всех биохимических реакций в ME-Model E. coli в масштабе генома iOL 1650 [31] с последовательностями и структурами их каталитических ферментов [65].Затем мы вычислили зависящие от температуры свойства фолдинга для каждого моделированного белка, на основании чего были сформулированы требования к шаперону для конкретных условий белка. Затем мы соединили состояние сворачивания клетки с ее метаболической сетью, позволив трем путям сворачивания (спонтанному, с помощью DnaK и с помощью GroEL / ES) конкурировать за сворачивание любого белка на основе рассчитанной потребности в шаперонах. Таким образом, модель была способна регулировать путь сворачивания in vivo каждого белка, чтобы минимизировать глобальные затраты, вложенные в биосинтез шаперона, и потребность в энергии для сворачивания.

Выбор параметров имеет решающее значение для применения моделей в масштабе генома для понимания биологических явлений на системном уровне. Модель FoldME построена на основе трех основных категорий параметров: 1) глобальных физиологических параметров, 2) скорости обмена метаболических ферментов in vivo и 3) термодинамических параметров, специфичных для белков. Первые две категории параметров являются общими для всех ME-моделей, поэтому для них установлены значения по умолчанию, впервые разработанные O’Brien et al.[31]. Специфические для белков термодинамические параметры, включая скорость кинетического сворачивания, свободную энергию разворачивания и склонность к агрегации, уникальны для модели FoldME. Эти параметры рассчитываются с использованием белковых последовательностей и структур с эмпирическими алгоритмами прогнозирования, которые хорошо известны в литературе. Более подробную информацию о формулировке модели, вычислении параметров и анализе чувствительности можно найти в Chen et al. [33].

Мы показали, что модель FoldME улучшила точность и объем предсказания оптимального состава протеома при широком спектре возмущений, включая температуру, доступность питательных веществ и генетические мутации, и поэтому подходит для изучения фенотипического распределения, представленного в данном документе. бумага.

Моделирование выборки штамма E. coli

Целью нашего метода выборки является оценка фенотипического распределения E. coli с использованием штаммов in silico, реконструированных для представления разнообразия встречающихся в природе штаммов. Мы предполагаем, что адаптация достигается за счет постепенного накопления большого количества мутаций, возникающих независимо, каждая из которых оказывает незначительное случайное влияние на затронутые гены. Чтобы смоделировать последствия этого долгосрочного динамического эволюционного процесса в масштабе генома и оценить его влияние на приспособленность, мы разрабатываем двухэтапный процесс: 1) выбираем гены для мутации в соответствии с вероятностью обнаружения мутации в каждом гене, и 2) определить молекулярный эффект мутации на соответствующий ген.

На первом этапе мы проанализировали генетические вариации 1765 штаммов E. coli , собранные из 1) базы данных PATRIC [66], 2) панели штаммов Ecoref [67] и 3) вручную подобранного набора прикрепленных -инвазивный штамм E. coli (AIEC). Мы составили белковые последовательности для 1566 кодирующих белок генов, присутствующих в модели FoldME, и выполнили попарное выравнивание последовательностей белка из каждого штамма с его гомологичной последовательностью в E. coli K12 MG1655 [68].Мы обнаружили в общей сложности 266 940 мутаций кодирующей области, включая 245 635 несинонимичных SNP, 16 591 делецию и 4714 вставок. Затем мы определили вероятность обнаружения мутации в гене как количество всех наблюдаемых мутаций в этом гене по сравнению с общим количеством мутаций кодирующей области. Затем нам нужно определить, какие гены несут мутации в каждом образце. Для этого мы сгенерировали случайное число от 0 до 1 для каждого гена. Если случайное число меньше частоты мутации гена, ген мутирован; в противном случае ген остается в форме дикого типа.Таким образом, мы воспроизвели вероятность наблюдения мутации в гене в естественных штаммах E. coli (S2 Рис).

На втором этапе мы изменили каталитическую эффективность и термостабильность ферментов, выбранных для мутации на первом этапе. Было известно, что полезные и пагубные эффекты мутаций распространяются экспоненциально, с множеством мутаций с малым эффектом и меньшим количеством мутаций с большим эффектом [69, 70]. Чтобы отразить экспоненциальное распределение положительного эффекта на уровне гена, мы масштабировали скорость оборота in vivo ( k eff ) затронутого фермента с экспоненциально распределенным случайным числом между 0.5 и 2. В то же время мы изменили термостабильность фермента (свободная энергия разворачивания Δ G ) на случайную величину от -2 до 2 ккал / моль, чтобы учесть (де) стабилизирующие мутации с небольшим эффектом. . Направление изменения эффективности и стабильности фермента считалось противоположным, учитывая плейотропные эффекты мутаций [71], так что, если эффективность фермента увеличивалась, его стабильность снижалась, и наоборот.

Наконец, чтобы представить стрессы окружающей среды, мы смоделировали 100 образцов деформации при каждой температуре от 25 до 46 ° C, в результате чего было проведено 2200 моделирования.

Чтобы проверить надежность этого процесса выборки, мы выполнили дополнительные серии моделирования со следующими модификациями: 1) зафиксировали количество мутировавших генов на 10%, 20% или 30% от общего количества смоделированных генов и выбрали мутации, предполагающие одинаковую частоту фиксации мутаций для всех генов; 2) нарушается только k eff или стабильность ферментов, выбранных для мутации; 3) использовал другой профиль дикого типа k eff согласно недавнему исследованию машинного обучения [72]; и 4) нарушили k eff мутировавшего фермента с более высокими коэффициентами масштабирования.Ни одна из этих модификаций процедуры выборки не изменила наш основной вывод относительно стратифицированного фенотипического ландшафта, определяемого мультимодальным распределением f ATPS . В качестве примера мы показали результат моделирования выборки, в котором k eff было масштабировано от 0,1 до 10 раз и от 0,01 до 100 раз (модификация № 4, S9 (C) Fig). В обоих случаях f ATPS распределены в тех же местах, что и на фиг. S9 (B), с различиями только в относительной амплитуде пиков приспособленности.Поэтому мы рассмотрели наш текущий выбор процедуры выборки и параметров, способных генерировать надежные фенотипические прогнозы с эволюционно значимыми генотипами.

Моделирование выборки с фиксированным

f ATPS

Чтобы подтвердить связь между мультимодальным распределением f ATPS и стратифицированной структурой ландшафта фенотипической пригодности, мы выполнили моделирование выборки, где f ATPS был ограничен пятью наиболее вероятными значениями: 0, 0.37, 0,53, 0,64 и 0,71. Ограничение было сформулировано следующим образом:

(1-п) · VATPS4rpp = p · (VPGK + VACKr + VPYK + VPPKr + VPPK2r + VSUCOAS + VPRPPS)

(1)

где V реакция _ имя обозначало поток соответствующей реакции, а p было значением, которым f ATPS было ограничено. Для каждого значения f ATPS было выполнено 24 моделирования выборки при каждой температуре от 25 до 46 ° C.Однако это сильное ограничение вызвало множество несовместимостей с выбранным генотипом, в результате чего были получены окончательные 2237 возможных и оптимальных решений, представленных в S8 Рис.

Моделирование выборки при фиксированной скорости роста

Разница в температуре роста привела к систематическим изменениям стабильности белка и скорость оборота ферментов in vivo, следовательно, разные скорости роста [33]. Чтобы исключить возможность того, что мультимодальное распределение f ATPS было результатом смещения, вызванного разницей в скорости роста при разных температурах, мы выполнили дополнительное моделирование выборки при одной конкретной температуре.В то же время было желательно покрыть как можно большую площадь нормы доходности. Таким образом, мы исследовали доступный диапазон q glc и Y (то есть значения, которые предоставляют возможные решения для роста клеток) при каждой температуре в ранее описанных 2200 симуляциях выборки (S9 (A), рис.). В целом, ниже оптимальной температуры роста, доступные диапазоны q glc и Y оба уменьшались при повышении температуры, что благоприятствовало выбору более низкой температуры.Затем мы рассмотрели совпадение с наиболее населенным диапазоном экспериментальных фенотипов (S1 (A), рис.), Где q glc варьировались приблизительно в диапазоне от 5 до 15 ммоль / гДВт / ч и Y от 0,3 до 0,55 гДВт / г. Объединив оба критерия, мы зафиксировали второй набор моделирования выборки при 30 ° C (S9 (A) Рис, красный).

Затем, чтобы максимизировать количество экземпляров в каждом дискретном режиме f ATPS и обеспечить прямое сравнение метаболических потоков, мы сфокусировали выборку по нескольким изоклинам μ .Мы выбрали шесть скоростей роста (значения указаны относительно скорости роста дикого растения при 37 ° C): 3 около средней скорости роста при 30 ° C (0,36, 0,44, 0,47), одна близка к верхнему пределу для роста при 30 °. C (0,65), а два чуть ниже нижней границы (0,18, 0,22). При моделировании с более высокой фиксированной скоростью роста было получено большое количество недопустимых решений, поэтому они не были включены. Результаты подтвердили, что при каждой моделируемой скорости роста f ATPS показало аналогичное множественное гауссово распределение, которое различается только относительным весом каждого гауссова.Из-за того же количества пиков и средних значений, мы представили в S9 (B) Fig совокупный результат для всех шести темпов роста вместе.

Подгонка к мультимодальному распределению

f ATPS

Мы предположили, что значение f ATPS для каждого аэротипа будет нормально распределенным. Отсюда следовало, что f ATPS , вычисленное на основе моделирования выборки, должно быть подогнано к смеси нескольких гауссовых распределений, каждое из которых представляет один аэротип.Количество гауссовых распределений (пиков) следует выбирать как количество аэротипов, определяемых на основе различимых метаболических () и протеомных состояний (). Таким образом, мы рассматриваем f ATPS = 0 (полностью ферментативный фенотип) как один «пик» и аппроксимируем оставшиеся данные четырьмя гауссианами с помощью Matlab.

Чтобы проверить, согласован ли наш выбор количества пиков, мы сравнили распределения, полученные из многих отдельных наборов моделирования выборки, в том числе с использованием различных стратегий выборки для анализа чувствительности.Распределение f ATPS постоянно показывало пять пиков, хотя высота пиков варьировалась. Пики около 0,0, 0,37 и 0,53 явно присутствовали во всех наборах данных, тогда как пики около 0,64 и 0,71 могли быть размыты при определенных условиях. Эта окончательная неопределенность, вероятно, возникла из-за нерешенной протеомной сложности фенотипов с высокой степенью респираторных заболеваний, что не должно ухудшать достоверность подбора и процесса отбора проб.

Бактериальные штаммы

E.Цепь переноса электронов coli содержит два типа ферментов: дегидрогеназу, которая окисляет донор электронов, и цитохромоксидазу, которая восстанавливает акцептор электронов (S10 (A), рис.). Чтобы создать мутантные штаммы, привязанные к определенному аэротипу, мы выбираем два фермента из каждой категории, которые нужно удалить из генома: NADH-дегидрогеназа I (NuoABCDEFGHIJKLMN) и NADH-дегидроназа II (Ndh) для дегидрогеназы; цитохром bo оксидаза (CyoABCD) и цитохром bd -I оксидаза (CydAB) для цитохромоксидазы.

Три из выбранных ферментов ETC являются мультибелковыми комплексами, и мы стремимся выбрать ген, который максимально нарушает функцию всего фермента. Для НАДН-дегидрогеназы I все субъединицы необходимы для сборки или стабильности функционального фермента [73]. Субъединица, кодируемая геном nuoB , содержит кластер N2 4Fe-4S, который может играть роль в активности фермента по транслокации протонов [74]. Для цитохрома bd -I оксидазы, хотя обе субъединицы необходимы для связывания компонентов гема b 595 и гема d цитохрома bd -I, субъединица II, кодируемая геном cydB , связывает структурную Кофактор убихинона-8, который может играть роль в сборке димера [75].Точно так же делеция каждого гена в опероне cyo приводит к нефункциональным ферментам, но мы решили разрушить cyoB , потому что он кодирует субъединицу I, которая участвует в транслокации протонов [76].

Четыре штамма с нокаутом одиночного гена ETC и четыре штамма с нокаутом двойного гена ETC были сконструированы с помощью метода трансдукции фага P1 [77] с использованием E. coli K-12 MG1655 (ATCC 700926) в качестве реципиента. напряжение. Коллекционные штаммы Keio использовали в качестве донорского штамма для создания кассет с нокаутом генов, содержащих маркер устойчивости к канамицину [78].Нокауты были подтверждены с помощью ПЦР и повторного секвенирования ДНК (таблица S3).

Характеристика фенотипа E. coli

Характеристики были выполнены с полной аэрацией при 37 ° C в пробирках с рабочим объемом 15 мл, содержащих среду с глюкозой M9, как описано в LaCroix et al. [34]. Культуры первоначально инокулировали из замороженных запасов глицерина и выращивали в течение ночи. Физиологическая адаптация была достигнута за счет экспоненциального роста на протяжении 2 пассажей от 5 до 10 поколений. Затем культуры переносили в свежую пробирку, и показания оптической плотности (ОП) спектрофотометра периодически снимали при длине волны 600 нанометров (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) до достижения стационарной фазы.

Образцы фильтровали через фильтр 0,22 микрометра (MilliporeSigma, Burlington, MA) одновременно с измерением OD и анализом фильтрата на концентрацию глюкозы с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния). ) с колонкой Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Скорости поглощения глюкозы при экспоненциальном росте определяли с помощью наилучшей линейной регрессии концентраций глюкозы по сравнению с сухой массой клеток, умноженной на скорости роста в том же диапазоне образцов.

Скорость поглощения кислорода каждой аэробной культурой определялась путем измерения скорости истощения растворенного кислорода в закрытой камере респирометра с использованием системы биологического контроля кислорода YSI 5300A, в которой использовались полярографические кислородные зонды типа Кларк (Cole-Parmer Instruments, Vernon Hills, IL). .

Пересеквенирование ДНК

Для определения мутаций, возникших в ходе адаптивной лабораторной эволюции штамма E. coli с дефицитом pgi , были выделены клоны с улучшенным ростом вдоль траектории ALE и выращены в минимальной среде M9 с добавлением 4 г / л глюкоза.Затем клетки собирали в процессе экспоненциального роста, и геномную ДНК экстрагировали с использованием системы очистки KingFisher Flex, ранее проверенной для высокопроизводительной платформы, упомянутой ниже [79]. Библиотеки секвенирования с дробовиком получали с использованием миниатюрной версии комплекта для подготовки библиотек, совместимого с Kapa HyperPlus Illumina (Kapa Biosystems). Экстракты ДНК были нормализованы до общего ввода 5 нг на образец с использованием акустического робота для обработки жидкостей Echo 550 (Labcyte Inc), и реакции ферментативной фрагментации, восстановления концов и лигирования адаптеров в масштабе 1/10 выполнялись с использованием устройства для обработки жидкостей Mosquito HTS. робот (TTP Labtech Inc).Адаптеры для секвенирования были основаны на протоколе iTru [80], в котором сначала были лигированы короткие универсальные адаптерные заглушки, а затем на последующей стадии ПЦР были добавлены специфичные для образца последовательности со штрих-кодом. Затем амплифицированные библиотеки и библиотеки со штрих-кодом были количественно определены с помощью анализа PicoGreen и объединены в приблизительно эквимолярных соотношениях перед секвенированием на приборе Illumina HiSeq 4000.

Сбор и анализ данных RNA-Seq

Суммарную РНК отбирали из дублирующих культур. Все штаммы выращивали на минимальной среде М9 с добавлением 4 г / л глюкозы.3 мл клеточного бульона (взятого при OD600 ∼ 0,6) немедленно добавляли к 2 объемам Qiagen RNAprotect Bacteria Reagent (6 мл), встряхивали в течение 5 секунд, инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут и сразу же центрифугировали в течение 10 минут при 17 500 об / мин. Супернатант декантировали, а осадок клеток хранили при -80 ° C. Осадки клеток размораживали и инкубировали с лизоцимом Readylyse, SuperaseIn, протеазой K и 20% SDS в течение 20 минут при 37 ° C. Общую РНК выделяли и очищали с использованием колонок RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) в соответствии с процедурами поставщика.Обработку ДНКазой на колонке проводили в течение 30 минут при комнатной температуре. РНК количественно определяли с помощью спектрофотометра (NanoDrop 1000, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA), а качество оценивали, проводя электрофорез РНК на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния). РРНК удаляли с использованием набора для удаления рРНК Illumina Ribo-Zero (грамотрицательные бактерии). Набор Stranded RNA-Seq Kit (Kapa Biosystems) использовали в соответствии с протоколом производителя для создания библиотек секвенирования со средней длиной вставки около 300 п.н.Библиотеки секвенировали на приборе Illumina HiSeq 4000.

Необработанные чтения секвенирования были получены, как описано выше, и сопоставлены с эталонным геномом {«type»: «entrez-nucleotide», «attrs»: {«text»: «NC_000913.3», «term_id»: «556503834» , «term_text»: «NC_000913.3»}} NC_000913.3 с использованием Bowtie 2.3.4.3 [81] со следующими параметрами «-X 1000 -N 1 -3 3». Обилие транскриптов было количественно определено с использованием summarizeOverlaps из пакета R GenomicAlignments со следующими параметрами: «mode =« IntersectionStrict », singleEnd = FALSE, игнорировать.strand = FALSE, preprocess.reads = invertStrand »[82]. Транскриптов на миллион (TPM) рассчитывали с помощью DESeq2, и лог-преобразованный TPM ( log 2 ( TPM + 1)), называемый log-TPM, был взят для последующего анализа. Значения log-TPM двух биологических повторов сильно коррелировали ( R 2 > 0,97), за исключением мутанта Δ ndh Δ cydB ( R 2 = 0,91). Неопределенность мутанта Δ ndh Δ cydB могла происходить из-за частичного нокаута одного из повторений, который показал относительно высокую экспрессию гена cydB .Мы считали, что определение аэротипа и другие количественные характеристики этого мутанта менее надежны по сравнению с другими.

Анализ главных компонентов (PCA) log-TPM показал, что первые четыре компонента могут объяснить 84% вариаций в профиле экспрессии. Первый главный компонент сильно коррелировал со скоростью обмена, такой как скорость поглощения глюкозы / кислорода и скорость производства ацетата, а второй — со скоростью роста. Эти компоненты, хотя и очень объясняющие, были обогащены кластерами генов (например,g., хемотаксис, биосинтез жгутика, метаболизм аминокислот, транспорт сахара и т. д.), которые не были специфичными для условий и фенотипов, которые нас интересовали. В качестве альтернативы, четвертый компонент, объясняющий 5,4% общей вариабельности, был высок обогащены генами, участвующими в цикле TCA, анаэробном дыхании и активности ETC. Следовательно, мы рассмотрели возможность выбора генов, наиболее репрезентативных для аэротипа, для последующего анализа иерархической кластеризации. Сначала мы вычислили корреляцию Спирмена между пятью фенотипическими параметрами ( μ , Y , q glc , qO2, q ac ) и нашим определением аэротипа при моделировании выборки. .Оказалось, что только q ac (корреляция Спирмена = -0,9; значение P = 4e-143) и Y (корреляция Спирмена = 0,87; значение P = 4e-120) показали значительную корреляцию. Затем мы вычислили корреляцию Пирсона между log-TPM и экспериментально измеренными фенотипическими параметрами и выбрали гены, которые сильно коррелировали с q ac и Y (P-значение <0,01), но не с μ. . В результате был получен набор из 391 гена, которые были использованы для создания диаграммы кластеризации, показанной на.Как и ожидалось, этот набор был обогащен генами, участвующими в окислительном фосфорилировании (17 из 94, значение P одностороннего биномиального теста = 0,004) и цикл TCA (7 из 27, значение P одностороннего биномиального теста = 0,009). . Паттерн кластеризации качественно напоминал паттерн, полученный с использованием всех генов в профиле экспрессии (всего 4314 генов), но при этом максимально увеличивал интересующий сигнал для облегчения анализа и интерпретации.

Вспомогательная информация

S1 Text
Сравнение «аэротипа» и соотношения P / O в качестве фенотипических дескрипторов для E.coli .

(PDF)

S2 Текст
Динамика адаптивной эволюции бактерий на стратифицированном фенотипическом ландшафте.

(PDF)

S1 Рис.
Фенотипические данные E. coli , измеренные в экспериментах.

(A) Визуализация сборника 199 экспериментальных измерений. Контуры плотности фенотипа наложены поверх экспериментальных данных (серые кружки). (B) Экспериментальное фенотипическое распределение, визуализируемое в зависимости от того, сделаны ли измерения для WT или эволюционировавших E.coli (вверху слева), для WT или штаммов с нокаутом гена (вверху справа), при различных условиях питания (внизу слева) и для разных штаммов E. coli (внизу справа).

(TIF)

S2 Рис.
Вероятность обнаружения мутации в гене в естественных штаммах E. coli фиксируется при моделировании выборки.

Сравнение распределений количества наблюдаемых мутаций на ген для 1765 встречающихся в природе E.coli (слева) и частота мутаций на ген в 2200 выборочных моделированиях (справа).

(TIF)

S3 Рис.
Анализ главных компонентов для сорока трех реакций центрального метаболизма, изображенных на.

Рисунки иллюстрируют наблюдаемую корреляцию между фенотипическим состоянием и метаболическими потоками, но лучше всего их можно понять с помощью определения «аэротип», представленного в последующих разделах. (A) Метаболические состояния пяти аэротипов можно четко разделить по первому основному компоненту (PC1), представляющему 61.1% вариаций данных. PC2 далее разлагает метаболические состояния на подтипы. (B) PC1 — единственный компонент, который коррелирует (корреляция Пирсона = 0,97) с потоком через АТФ-синтазу (ATPS4rpp, показан красным). Следовательно, вариации данных, содержащиеся в PC1, лучше всего отражают наблюдаемые различия в метаболических состояниях между разными аэротипами. Например, потоки через цикл TCA положительно коррелируют с PC1, следовательно, поток через АТФ-синтазу. Эта корреляция указывает на то, что по мере того, как выход биомассы ( Y ) уменьшается вдоль μ -изоклина (аэротип уменьшается с v до i ), поток через цикл TCA также уменьшается.Точно так же потоки через переток ацетата отрицательно коррелируют с PC1, следовательно, когда Y уменьшается, поток через перетекание ацетата увеличивается. Противоположный знак корреляции между потоками через две ветви путей гликолиза хорошо отражает тенденцию, согласно которой поток гликолиза медленно переключается с oxPPP на EMP по мере того, как аэротип уменьшается с v до i . PC2 (и его основные компоненты) не коррелируют с потоком через АТФ-синтазу и не обсуждаются более подробно для целей данной статьи.Названия реакций представляют собой стандартные идентификаторы реакций, доступные для поиска в базе данных BIGG (http://bigg.ucsd.edu/). oxPPP: окислительный пентозофосфатный путь; EMP: дорога Эмбден – Мейерхоф – Парнас; ED: Путь Энтнера-Дудорова.

(TIF)

S4 Рис.
Экспериментальные доказательства корреляции между выходом биомассы и использованием путей.

(A) Фенотипические данные 20 штаммов E. coli в среде с минимальной глюкозой выделены в области «скорость-выход».Данные включают два штамма дикого типа при 37 ° C (синий кружок, обозначенный «wt»), один штамм дикого типа при 42 ° C (красный кружок, обозначенный «wt»), 7 штаммов, эволюционировавших при 37 ° C ( синие кружки, помеченные словом «эль» и номером штамма), и 10 штаммов эволюционировали при 42 ° C (красные кружки, помеченные словом «эль» и номером штамма). (B) Массовая доля репрезентативного пути рассчитывается с использованием всех генов, участвующих в соответствующем пути. Показана корреляция Пирсона между выходом биомассы и массовой долей каждого пути.Использование трех путей, связанных с аэробным дыханием, в значительной степени коррелирует с выходом биомассы (выделено жирным шрифтом с указанием их значений P). (C) Выход биомассы в зависимости от массовой доли генов, участвующих в окислительном фосфорилировании. Каждая точка соответствует деформации, обозначенной как (A). (D) Выход биомассы в зависимости от массовой доли генов, участвующих в цикле TCA.

(TIF)

S5 Рис.
Реакции продукции АТФ и их вклад в фенотипическое расстояние оцениваются с помощью моделирования выборки.

(A) Подробная информация о реакциях производства АТФ в E. coli . Краткие и полные названия метаболитов перечислены ниже. 13dpg: 3-фосфо-D-глицероилфосфат; 3 пг: 3-фосфо-D-глицерат; акт: ацетилфосфат; пир: пируват; пеп: фосфоенолпируват; суккоа: сукцинил-КоА; coa: коэнзим-A; prpp: 5-фосфо-альфа-D-рибозо-1-дифосфат; r5p: альфа-D-рибозо-5-фосфат. Доля общего АТФ, производимого каждой реакцией, значительно варьируется. Диапазон вариации моделирования выборки указан в столбце «Доля».(B) Доля вариаций в фенотипическом пространстве скорость-выход, объясняемых указанными реакциями производства АТФ. 89,5% вариаций фенотипического расстояния можно объяснить первыми шестью реакциями, продуцирующими АТФ. Среди них наибольший вклад внесли реакции окислительного фосфорилирования ATPS4rpp и PPKr. (C) Сравнение между фактическим фенотипическим расстоянием на плоскости скорости выхода и восстановленным из шести реакций, продуцирующих АТФ. Смоделированный фенотип определяется четырехэлементным вектором, содержащим скорость поглощения глюкозы, скорость продуцирования ацетата, скорость роста и выход биомассы.Другие типичные фенотипические измерения сильно коррелируют с одной или несколькими выбранными величинами и поэтому не включаются в расчет. Затем фенотипическое расстояние вычисляется как евклидово расстояние этого вектора по отношению к раствору дикого типа при 37 ° C. Предикторы ступенчатой ​​линейной регрессии принимаются как доля АТФ, продуцируемая каждой реакцией, указанной в (A).

(TIF)

S6 Рис.
Линейная взаимосвязь между f ATPS и фенотипом скорость-урожай при каждой конкретной скорости роста.

(A) Распределение пригодности 2200 смоделированных деформаций на плоскости скорости выхода (то же, что показано на). Смоделированные деформации вдоль шести изоклин μ , которые используются в последующем анализе, показанном на панели B, выделены. Скорости роста, показанные на изоклинах μ , вычислены относительно скорости роста дикого типа, рассчитанной при 37 ° C. (B) Вдоль каждого μ -изоклина расчетная доля общего клеточного АТФ, продуцируемого АТФ-синтазой ( f ATPS ), линейно коррелирует с выходом биомассы ( Y , вверху) и скоростью поглощения глюкозы ( q glc , внизу), с положительным и отрицательным наклоном соответственно.Пересечения этой линейной аппроксимации при минимальном и максимальном значениях f ATPS (0 и 0,83 соответственно) дают возможность оценить возможный диапазон q glc и Y . Оценки для каждой скорости роста могут быть связаны, чтобы провести границу плоскости нормы урожайности (заштрихованная серая область на панели A). Доступный диапазон фенотипического пространства, созданного таким образом, охватывает большинство точек данных как из экспериментов, так и из моделирования.

(TIF)

S7 Рис.
Производство АТФ через АТФ-синтазу определяется аэротипом.

(A) Выход АТФ через АТФ-синтазу положительно коррелирует с f ATPS (следовательно, положительно коррелирует с аэротипом, как определено в последующих разделах результатов), но не с массовой долей АТФ синтаза в протеоме. (B) Экспрессия АТФ-синтазы зависит от скорости роста и температуры.

(TIF)

S8 Рис.
Более тонкая структура фитнес-ландшафта.

(A) Топография фитнес-ландшафта, восстановленная из моделирования ограниченной выборки при 5 наиболее вероятных значениях f ATPS значений: 0, 0,37, 0,53, 0,64 и 0,71. (B) После того, как f ATPS определено в стратегии производства энергии, более тонкие структуры можно увидеть на фенотипическом ландшафте. Распределения f PGK , f ACKr и f PYK на каждом фиксированном f f ATPS multimal value также показывают различные значения mul720.Круговые диаграммы показывают допустимую стратегию производства энергии, которая представляет более 95% решений для каждого фиксированного f ATPS , все показанные доли имеют стандартные отклонения менее 0,02. (C) При фиксированном f ATPS выход биомассы отрицательно коррелирует с соотношением f ACKr / f PGK . Поскольку ацетат секретируется через поток ACKr и биомасса не образуется, увеличение f ACKr снижает выход биомассы.(D) При фиксированном f ATPS общий выход АТФ положительно коррелирует с соотношением ( f ACKr + f PYK ) / f PG . Это соотношение отражает относительную эффективность всех реакций, продуцирующих АТФ, с точки зрения продукции АТФ на единицу субстрата. Чем более неэффективна реакция PGK (2 АТФ на поглощение глюкозы, что отражается в значении аппроксимирующей кривой при (fACKr + fPYK) fPGK = 0 и f ATPS = 0), тем ниже общий Выход АТФ составляет.Поскольку выход окислительного фосфорилирования намного выше (~ 34 АТФ на глюкозу), общий выход АТФ увеличивается с f ATPS при фиксированном ( f ACKr + f PYK ) / f PGK соотношение.

(TIF)

S9 Рис.
Согласованность в распределении f ATPS из различных наборов моделирования отбора проб деформации.

(A) Фенотипические вариации при каждой температуре. На этом графике средние значения Y и q glc , рассчитанные для отобранных штаммов при каждой температуре, обозначены кружком, затем диапазон доступных значений обозначен горизонтальными и вертикальными линиями, проходящими через среднее . Для T = 25 ° C, 30 ° C, 37 ° C и 40 ° C для справки показан оптимальный фенотип дикого типа (квадрат). Для T = 25 ° C, 30 ° C и 40 ° C изменение предпочтительного аэродинамического типа показано разницей в распределении f ATPS .Нарисовано восемь мк -изоклин, каждая из которых помечена относительной скоростью роста по отношению к смоделированной оптимальной скорости роста WT при 37 ° C. Распределение f ATPS при 30 ° C наилучшим образом отражает характеристики полного распределения, поэтому мы выбираем эту температуру для последующего анализа. (B) Распределение f ATPS из 368 симуляций выборки, выполненных при 30 ° C и выбранной скорости роста. Подгонка к смеси четырех гауссовых распределений показывает соответствие наблюдаемому стратифицированному распределению, показанному на.(C) f Значение ATPS показывает аналогичное мультимодальное распределение, поскольку максимальное кратное изменение эффективности фермента увеличивается до 10 и 100 раз при моделировании выборки.

(TIF)

S10 Рис.
Сравнение вычисленного E. coli аэротипа и соотношения P / O.

(A) Основные белковые комплексы, участвующие в обороте хинона при моделировании выборки. Формиатдегидрогеназа N и O катализируют одну и ту же реакцию, поэтому для простоты обозначены как один и тот же комплекс (FDN / O).График нормализованной экспрессии указанных белковых комплексов в рамке показывает различное использование фермента ETC между различными аэротипами. Чтобы сделать возможным прямое сравнение, рассчитанная массовая доля ферментных комплексов нормируется на общую массовую долю всех рибосомных белков, чтобы устранить смещение, возникающее из-за разных скоростей роста. Центральная красная линия прямоугольной диаграммы показывает медиану, нижний и верхний края указывают 25 и 75 процентили, а усы простираются до 1.В 5 раз больше межквартильного размаха. Размер выборки в каждом аэротипе такой же, как и в. (B) Активированные реакции ETC в моделировании 368 отбора проб показаны с их относительными вкладами в поток восстановления хинона и поток окисления хинола. Рассчитанный выход биомассы и выработка ацетата показаны справа, чтобы представить соответствующий смоделированный фенотип. (C) f ATPS и соотношение P / O предварительно разделены на пять отдельных групп на основе их мультимодального распределения и сопоставлены с оптимальными решениями, показанными на панели B.(D) Сравнение экспериментальных и смоделированных относительных количеств выбранных генов ( ndh , cyoB ) по отношению к АТФ-синтазе. Длина полосы и полосы ошибок представляют собой среднее отношение и стандартное отклонение для каждого аэротипа, как определено в эксперименте и на панели C для моделирования.

(TIF)

S11 Рис.
Характеристики роста нокаутных штаммов ETC при трех различных температурах.

Мутанты Δ ndh Δ cydB , Δ cydB были выбраны для представления высших аэротипов v / iv , а Δ nuoB Δ cyoB был выбран для представления мутанта. нижний аэродинамический ii .Данные роста при 30 ° C и 37 ° C точно воспроизводят ожидаемую тенденцию, так что Δ ndh Δ cydB и Δ cydB остаются в области для аэротипа iv и Δ nuoB Δ cyoB в районе для аэротипа ii . При 42 ° C все три штамма производят более низкую биомассу из-за температурного стресса. Тем не менее, они сохраняют хорошее разделение на уровне доходности, представляющем ограничения аэротипа, вызванные удалением соответствующих генов ETC.Таким образом, представленные данные подтверждают мнение о том, что дифференциальное использование генов ETC определяет фенотипический аэротип клетки.

(TIF)

S12 Рис.
Фенотипические результаты эксперимента ALE на стратифицированном ландшафте приспособленности.

(A) Схема предлагаемой иерархической стратегии производства энергии. Синие и красные стрелки соответствуют термодинамическому и дыхательно-ферментационному компромиссу соответственно. (B) Крупномасштабное представление ландшафта пригодности на плоскости доходности.Цветовой градиент указывает уровень сложности протеома, где синий представляет более простой протеом, а красный — более сложный протеом. (C) Пример адаптивной траектории во время эволюции штамма с дефицитом pgi . (D) Промежуточные эволюционные состояния были выбраны на указанных этапах и охарактеризованы на плоскости скорость-выход.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

2019 © Все права защищены. Карта сайта