Aero beg: Добро дошли на Аеродром Никола Тесла Београд

Q) LYBA / QGAXX / I / BO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2108120000 C) PERM

E) В ТАБЛИЦЕ КОДИРОВКИ ИЗМЕНИТЬ КОД

WPT BE498 ПРОЧИТАТЬ 443107.4N SUP 0202918.8E

REF , СТРАНИЦА 4.

СОЗДАНО: 07 июл 2021 08:41:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM GNSS для полетов для конкретных аэродромов / действует с четверга 12 августа 2021 года с 00:00 до четверга 26 августа 2021 года в 23: 59

Q) LYBA / QGATT / I / BO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2108120000 C) 2108252359

E) TRIGGER NOTAM — AIRAC WEF 12 SUP 5/5 21 августа.

ВВЕДЕНИЕ ПРОЦЕДУРЫ TRIAL RNP AR APCH.

СОЗДАНО: 01 июля 2021, 14:39:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Самолеты стоят / действительны с четверга 17 июня 2021 года в 14:11

Q) LYBA / QMPCS / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106171411 C) PERM

E) НОВЫЙ ФАРТУК E. ВВЕДЕНИЕ:

1. ПОДСТАВКА ACFT E1: МАКСИМАЛЬНЫЙ РАЗЪЕМ КРЫЛА 36,00M, КОНТРОЛЬНОЕ ТОЧЕК INS

04817325

,

2.ПОДСТАВКА ACFT E2: МАКСИМАЛЬНЫЙ РАЗМЕТ КРЫЛА 36,00M, КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА INS

444856.33N 0201730.84E,

3. ПОДСТАВКА ACFT E3: МАКСИМАЛЬНЫЙ РАЗМЕТ КРЫЛА 36,00M, КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА INS

444854.88N 0201729.55E.

ПРИМЕЧАНИЕ. ДО ПУБЛИКАЦИИ В AIP ГРАФИЧЕСКАЯ ПРЕЗЕНТАЦИЯ ЯВЛЯЕТСЯ AVBL по номеру

ВЕБ-САЙТ: WWW.BEG.AERO

ВНИМАНИЕ: ТАКСИ ИСПОЛЬЗУЕТ МОЩНОСТЬ MNM, ЧТОБЫ СНИЗИТЬ ВЗРЫВ

.

СОЗДАНО: 17 июня 2021, 14:12:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Фартук / действителен с четверга 17 июня 2021 года в 14:07

Q) LYBA / QMNCS / IV / B / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106171407 C) PERM

E) НОВЫЙ Фартук E СО СТЕНДАМИ ACFT E1, E2 и E3, УСТАНОВЛЕННЫЙ ПРОТИВОПОЛОЖЕНИЕМ

ОБЩИХ АВИАЦИОННЫХ БУТОНОВ С ДВУСТОРОННИМИ ДВУСТОРОННИМИ БУМАГАМИ .

ФАРТУК E — PCN 74 / R / B / W / T CONC.

ИСПОЛЬЗУЙТЕ TWY G, ЧТОБЫ ДОСТУПИТЬ К СТЕНДАМ ACFT E1, E2 И E3, ПОДОЖДИТЕ СЛЕДУЮЩИЕ ЗА МНЕ

НА СТОП-БАР.

ПОСЛЕДУЮЩИЕ МНЕ УКАЗАНИЯ К ФАРТУКУ E.

СИСТЕМА ВИЗУАЛЬНЫХ ДОКУМЕНТОВ НЕ AVBL.

СОЗДАНО: 17 июн 2021 14:08:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Процедура захода на посадку по приборам / действительна с четверга 17 июня 2021 года в 00:00

Q) LYBA / QPICH / I / NBO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106170000 C) PERM

E) ИЗМЕНИТЬ ПОДШИПНИК ФОРМИРОВАНИЯ FAF И MAPT FIX

ЗНАЧЕНИЕ 122.44 ГРАДУСОВ BGD VOR ДЛЯ ЧТЕНИЯ 117,44 ГРАДУСОВ BGD VOR.

REF AIP AD 2 LYBE 6.4-6

СОЗДАНО: 16 июня 2021 г. 11:35:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Стойки для самолетов / действительно со среды 16 июня 2021 г. с 16:00 до субботы 16 октября 2021 г. в 22:00

Q) LYBA / QMPCS / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106161600 C) 2110152200 EST

E) NEW TEMPO ACFT STANDS NC, И N2C ПРЕДНАЗНАЧЕН НА БАРТОНЕ №

FOLLOW FOLLOW ME VEHICLE FM СТОП-БАР B ИЛИ ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ УДЕРЖАНИЕ

ПОЛОЖЕНИЕ A1, ЗАТЕМ ИНСТРУКЦИИ MARSHALLER ПО ПАРКОВКЕ НА ПОДСТАВКАХ

ACFT.

НАЗАД СТЕНДЫ FM ACFT ОБЯЗАТЕЛЬНЫ ИЗ-ЗА WIP.

СОЗДАНО: 15 июн 2021 09:53:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Фартук / действителен со среды 16 июня 2021 года с 16:00 до субботы 16 октября 2021 года в 22:00

Q ) LYBA / QMNXX / IV / BO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106161600 C) 2110152200 EST

E) APRON N — ОБЛАСТЬ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ОПЕРАТОРА РЕКЛАМЫ.

СОЗДАНО: 15 июн 2021 09:48:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM РД / действительны со вторника 15 июня 2021 года в 08:57 по субботу 16 октября 2021 года в 23:59

Q) LYBA / QMXLC / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106150857 C) 2110152359 EST

E) ЧАСТЬ TWY F BTN СТОПОРНАЯ ПАНЕЛЬ F4 И F6 CLSD.

СОЗДАНО: 15 июн 2021 08:57:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM РД / действительны со вторника 15 июня 2021 года в 08:54 по субботу 16 октября 2021 года в 23:59

Q) LYBA / QMXLC / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106150854 C) 2110152359 EST

E) TWY FA И TWY FB CLSD ИЗ-ЗА WIP.

СОЗДАНО: 15 июня 2021 года, 08:55:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Огни центральной линии РД / действительно со вторника 15 июня 2021 года в 08:52 по субботу 16 октября 2021 года в 23:59

Q) LYBA / QLXAS / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2106150852 C) 2110152359 EST

E) ФОНАРЬ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЛИНИИ ДВОЙНЫМ НА ФАЙДЕ NU / S.

СОЗДАНО: 15 июн 2021 08:53:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Самолеты стоят / действительны с понедельника 24 мая 2021 года в 06:36 по понедельник 23 августа 2021 года в 21:50

Q) LYBA / QMPLT / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105240636 C) 2108232150 EST

E) МАКСИМАЛЬНАЯ ДЛИНА ACFT ДЛЯ СТЕНДОВ ACFT A2, A3 и A4 ДО 27,2 М.

СОЗДАНО: 24 мая 2021 г., 06:37:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Система стыковки / действует с понедельника 24 мая 2021 года в 06:34 по понедельник 23 августа 2021 года в 21:50

Q) LYBA / QFDXX / I / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105240634 C) 2108232150 EST

E) ВИЗУАЛЬНАЯ СИСТЕМА УКАЗАНИЯ ПО ДОКУМЕНТУ НА ACFT STAND A2, A3 И A4 U С.

СОБЛЮДАЙТЕ ТОЛЬКО ИНСТРУКЦИИ MARSHALLER.

СОЗДАНО: 24 мая 2021 г., 06:35:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Aerodrome / действителен с понедельника 17 мая 2021 года в 10:12 по понедельник 16 августа 2021 года в 21:50

Q) LYBA / QFALT / IV / NBO / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105171012 C) 2108162150 EST

E) AD CLSD ДЛЯ ACFT С КОДОМ F.

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Стойки для самолетов / действительны с 12:00 пятницы 7 мая 2021 г. до 12:00 субботы 7 августа 2021 г.

Q) LYBA / QMPLT / IV / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105071200 C) 2108071200 EST

E) МАКСИМАЛЬНАЯ ДЛИНА ACFT ДЛЯ ПОДСТАВКИ ACFT C7, C8, C9 И C10 ДО 27.16М.

СОЗДАНО: 07 мая 2021, 11:42:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

NOTAM Система стыковки / действует со среды 5 мая 2021 года с 12:24 по четверг 5 августа 2021 года в 21:50

Q) LYBA / QFDXX / I / M / A / 000/999 / 4449N02018E005

A) LYBE B) 2105051224 C) 2108052150 EST

E) ВИЗУАЛЬНАЯ СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ ДОК-СТАНДОМ ACFT STAND C6 U / S.

СОБЛЮДАЙТЕ ТОЛЬКО ИНСТРУКЦИИ MARSHALLER.

СОЗДАНО: 05 мая 2021 12:25:00

ИСТОЧНИК: EUECYIYN

Стратификация бактериальных ландшафтов фитнеса на основе протеомного распределения, связанного с дискретными аэротипами

Abstract

Фитнес-ландшафт — это концепция, обычно используемая для описания эволюции к оптимальные фенотипы.Его можно свести к механистическим деталям, используя модели в масштабе генома (GEM) из системной биологии. Мы используем недавно разработанные GEM-модели метаболизма и экспрессии белка (ME-модели) для изучения распределения фенотипов Escherichia coli на плоскости скорость-выход. Мы обнаружили, что измеренные фенотипы распределяются неравномерно, образуя сильно стратифицированный ландшафт приспособленности. Системный анализ симуляций ME-модели предполагает, что эта стратификация является результатом дискретных стратегий генерации АТФ.Соответственно, мы определяем «аэротипы», фенотипический признак, который характеризует, как сбалансированный протеом может достичь заданной скорости роста путем модуляции 1) относительного использования путей окислительного фосфорилирования, гликолиза и ферментации; и 2) дифференциальное использование ферментов цепи переноса электронов. Эта глобальная, количественная и механистическая интерпретация системной биологии ландшафта приспособленности, сформированного при распределении протеома, предлагает фундаментальное понимание бактериальной физиологии и динамики эволюции.

Авторский обзор

Модели в масштабе генома позволяют количественно прогнозировать бактериальные фенотипы и детально описывать лежащее в основе оптимальное распределение протеома. Таким образом, теперь мы можем анализировать фенотипический потенциал большого количества генотипов Escherichia coli , выращенных в различных условиях, что приводит к обнаружению стратифицированного распределения фенотипов. Наблюдаемое распределение определяется различными стратегиями генерации АТФ, определяемыми как «аэротипы», связанными с оптимальным распределением протеома, модулируемыми при дифференциальном использовании ферментов транспортной цепи электронов.Этот механистический подход предлагает нам понимание ландшафта фитнеса на уровне генома и фундаментальную интерпретацию бактериальной физиологии и динамики эволюции.

Введение

Ландшафт пригодности Сьюэлла Райта [1] представлял собой раннюю попытку проиллюстрировать сложную взаимосвязь генотип-приспособленность в графической форме, которая позволяет легко концептуализировать эволюционную динамику. Технологические разработки в различных областях, включая мутагенез, эксперименты по эволюции микробов и высокопроизводительные методы секвенирования ДНК, теперь превратили эту концепцию из метафоры в реальные данные, позволяющие реконструировать эмпирические ландшафты приспособленности [2–4].Обычно изучаются два класса таких ландшафтов, чтобы изучить, как естественный отбор может привести популяцию к вершине пика приспособленности. Первый построен на основе дискретности белковых последовательностей, где эволюция моделируется как движение через промежуточные звенья эволюции по возможным мутационным путям. Это дискретное представление полезно для оценки вероятности эволюционных исходов [5] и демонстрации того, как молекулярные и эпистатические взаимодействия ограничивают количество доступных эволюционных путей [6–9].Однако экспериментальные исследования и последующее математическое моделирование ландшафта приспособленности ограничиваются хорошо охарактеризованным апостериорным отбором мутаций в изначально многомерном пространстве генотипов. Вторая модель определяет отношения фенотип-приспособленность в непрерывном и многомерном фенотипическом пространстве. Он способен адаптировать изменения в структуре ландшафта для многих видов и сред [10–12], но с ослабленной способностью связывать изменение приспособленности непосредственно с конкретным генетическим и молекулярным механизмом.

Эти хорошо изученные модели ландшафта приспособленности, дискретные или непрерывные, обращаются к эволюционной динамике в направлении оптимального фенотипа на основе редких полезных мутаций, которые возникают исторически или в ходе экспериментов по эволюции микробов [13]. Направленная эволюция ускоряет поиск полезных мутаций в многомерном пространстве последовательностей путем принудительного отбора желаемой функции и отбрасывания этих вариантов без улучшения. Этот мощный метод способен прояснить молекулярные механизмы адаптации и эволюционного компромисса в свойствах белков [14] в различных средах [15], что значительно обогатит наше понимание адаптивной траектории.Однако эффекты приспособленности для большинства мутаций, возникающих в природе, нейтральны, слегка вредны и немного полезны [16]. Распределение эффектов приспособленности этих спонтанных мутаций в естественных бактериальных популяциях остается неясным.

Альтернативный подход к изучению ландшафта приспособленности и фенотипического распределения исходит из пространства решений метаболической модели в масштабе генома (М-модель) [17, 18]. Модели в масштабе генома явно вычисляют, как оптимизация приспособленности организма на системном уровне достигается за счет естественной эволюции, с учетом ограничений на максимально возможное количество факторов.К ним относятся метаболическая нагрузка, распределение ресурсов и взаимодействия между геном и клеточной средой [19]. Способность моделей предсказывать фенотипы и быстро проверять миллионы генотипов позволяет исследовать изменения в оптимальном пространстве решений при делеции гена, обеспечивая ценную информацию о влиянии существенности гена [20] в различных условиях [21], пластичности и устойчивость метаболических сетей [22] и влияние эпистазных взаимодействий на распределение приспособленности [23, 24].

Расширение М-моделей с целью включения ограничений на стоимость биосинтеза белка повысило точность фенотипических прогнозов для различных организмов в различных средах [25–28]. Геномные модели метаболизма и экспрессии белка (ME-модели) для E. coli , в частности, явно включают полную реконструкцию путей транскрипции и трансляции, чтобы дать возможность количественного прогнозирования распределения протеома на уровне генов [29–2] 31] и способность предсказывать эволюционные исходы [32].Более поздняя разработка дополнительно учитывает зависящую от температуры каталитическую эффективность и термостабильность всех ферментов в ME-модели (FoldME-модель [33]), что позволяет четко сформулировать эффект мутации гена в отличие от прямого гена. удаление. Это последнее улучшение дает нам возможность оценить фенотипическое распределение естественных популяций E. coli в условиях фитнеса.

Здесь мы собираем и анализируем большие количества E.coli фенотипического роста в плоскости скорость-урожай и обнаруживают устойчивую неоднородность в распределении приспособленности. Фенотипы, определенные как с помощью вычислений, так и экспериментально, отображают несколько различных фенотипических категорий, которые распределяются полосами на уровне доходности и образуют ландшафт со «стратифицированной» топологией. Затем мы показываем с помощью подробного анализа метаболических потоков и экспрессии белков, что стратифицированная топография этого фенотипического ландшафта приспособленности может быть полностью описана стратегией производства энергии, которая, в свою очередь, определяется балансом между затратами на выделение протеома и метаболической эффективностью Производство АТФ.Интересно, что мы обнаружили, что простая величина — доля общего АТФ, которая генерируется АТФ-синтазой ( f _ATPS ) — способна описать стратификацию. Следовательно, мы определяем E. coli «аэротипами» на основе мультимодального распределения f _ATPS , модулированного посредством дискретного использования ферментов транспортной цепи электронов. Аэротип не только описывает дыхательное поведение клеток, но также указывает на соответствующее метаболическое состояние и протеомные композиции.Наконец, мы обсуждаем, как аэротип, как эффективный дескриптор пригодности, можно использовать для решения важных биологических вопросов, таких как предсказуемость микробной эволюции и интерпретация компромисса между нормой и урожайностью.

Результаты

Стратифицированная структура в ландшафте фенотипической приспособленности

Мы использовали наиболее фундаментальные параметры роста бактерий, выход биомассы ( Y ) и скорость поглощения субстрата ( q ), чтобы охватить фенотипическое пространство для E.coli (Материалы и методы). Чтобы получить полное представление о распределении приспособленности, мы сначала составили сборник экспериментальных фенотипов роста из литературы, дополненной измерениями, полученными в наших экспериментах по адаптивной лабораторной эволюции (ALE) (материалы и методы и ссылки в них). Этот набор данных ( n = 199) включает характеристики различных встречающихся в природе штаммов E. coli , эволюционирующих мутантов с нокаутом генов и рост в различных питательных условиях.Сразу заметно, что регионы с высокой и низкой урожайностью густо заселены, но промежуточные области (0,2 < Y <0,3 gDW / g ) почти пусты (S1 Рис.).

Является ли наблюдаемое неравномерное распределение фенотипа скорости выхода результатом недостаточной выборки из экспериментальных данных или фундаментальным свойством, определяемым структурой генома и метаболической сети клетки? Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали модель FoldME [33] для расчета фенотипической пригодности для большого количества штаммов in silico, которые отбирают генетические вариации встречающегося в природе E.coli (Материалы и методы). Чтобы осуществить такой отбор штаммов, мы сначала выбрали гены для мутации в соответствии с рассчитанной частотой фиксированных мутаций для каждого гена (S2 фиг.). Затем мы определили молекулярный эффект выбранной мутации, варьируя каталитическую эффективность выбранного фермента ( k _eff ) и термостабильность (Δ G ) на случайную, но небольшую величину (дополнительную информацию см. В разделе «Материалы и методы»). подробности). Наконец, рост отобранных штаммов моделировали в среде с минимальным содержанием глюкозы при колебаниях температуры от 25 ° C до 46 ° C, чтобы учесть влияние как генетических мутаций, так и изменений окружающей среды.

Рассчитанные эффекты пригодности для штаммов in silico были спроецированы на плоскость нормы урожайности. Контурная диаграмма всего 2200 отобранных образцов штаммов E. coli () хорошо подтверждает неравномерное распределение, наблюдаемое на основе экспериментальных данных. Что еще более важно, он предлагает характерное представление для «ландшафта фенотипической приспособленности», в котором фенотипы роста плотно группируются вдоль нескольких гиперболических линий на плоскости скорость-урожай (обозначены синими стрелками), но редко попадают между этими стратифицированными пиками плотности.

(A) Эффект пригодности, рассчитанный для 2200 in silico штаммов E. coli , демонстрирует стратифицированное распределение фенотипов на плоскости скорость-урожай. Синие стрелки указывают населенные районы, внутри которых распределение метаболических потоков остается относительно постоянным. Две изоклины μ выделены сплошными красными линиями.Цифры в незакрашенных кружках показывают расположение четырех штаммов in silico, выбранных для анализа метаболического потока, показанного на панели B. (B) Четыре репрезентативных метаболических состояния изображены распределением потоков основных путей в центральном метаболизме, включая путь гликолиза (метаболиты окрашен в зеленый цвет), окислительный пентозофосфатный путь (oxPPP, желтый) и цикл TCA (черный). Ключевые метаболиты, указанные на рисунке: glc: глюкоза; g6p: D-глюкозо-6-фосфат; g3p: глицеральдегид-3-фосфат; f6p: D-фруктозо-6-фосфат; пир: пируват; 6pgc: 6-фосфо-D-глюконат; пеп: фосфоенолпируват.Рассчитанные потоки каждого состояния окрашены в логарифмическую шкалу. (C) Распределение вычисленного f _ATPS , подогнанного к смеси четырех распределений Гаусса. Результат показывает четыре пика с центрами 0,37, 0,53, 0,64 и 0,71. Дополнительный пик виден при f _ATPS = 0. Пики в мультимодальном распределении f _ATPS сильно коррелируют с населенными областями на плоскости нормы урожайности, показанной синими стрелками на панель А.

Метаболическая локализация продукции АТФ стратифицирует ландшафт фенотипической приспособленности.

Чтобы объяснить наблюдаемую стратификацию в распределении фенотипов, мы сначала исследовали метаболические особенности, характеризующие моделируемые образцы в каждой населенной области на плоскости скорость-выход. Интересно, что решения вдоль густонаселенных гиперболических линий (синие стрелки на рисунке), где q и Y положительно коррелированы, имеют схожие черты в их распределении потоков в центральном метаболизме (S3 рис.).Напротив, образцы, расположенные вдоль линий постоянной скорости роста ( μ, -изоклины, красные сплошные линии), показывают устойчивые вариации метаболических состояний, которые коррелируют со сдвигами в фенотипе скорость-урожай.

В частности, по мере того, как Y уменьшается вдоль μ -изоклина, следующие изменения метаболического состояния могут быть идентифицированы с помощью анализа основных компонентов (и S3 фиг.): 1) количество АТФ, продуцируемого АТФ-синтазой, уменьшается; 2) поток через цикл трикарбоновой кислоты (ТСА) уменьшается; 3) общий поток через путь гликолиза увеличивается; 4) секреция ацетата увеличивается; и 5) общая сложность метаболизма, измеряемая количеством активных реакций, снижается.Мы проанализировали данные экспрессии 17 штаммов E. coli , эволюционировавших в среде с минимальной глюкозой при 37 ° C [34] и 42 ° C [35], и подтвердили первые два рассчитанных тренда с положительной корреляцией между Y и общая массовая доля генов, участвующих в цикле TCA и окислительном фосфорилировании (S4 фиг.).

Мы заметили, что изменение потока реакций производства энергии хорошо коррелирует со сдвигом метаболического состояния и фенотипической локализации. Таким образом, мы вычислили долю общего АТФ, продуцируемого восемью АТФ-продуцирующими реакциями: 1) производство АТФ с помощью АТФ-синтазы (ATPS4rpp) и реакций, катализируемых полифосфаткиназой (PPKr и PPK2r) при окислительном фосфорилировании; 2) реакции, катализируемые фосфоглицераткиназой (PGK) и пируваткиназой (PYK) в низшем пути гликолиза; 3) реакция, катализируемая ацетаткиназой (ACKr) при смешанной кислотной ферментации; 4) реакция, катализируемая сукцинил-КоА синтетазой (SUCOAS) в цикле TCA; и 5) реакция, катализируемая рибозо-фосфатдифосфокиназой (PRPPS) в биосинтезе нуклеотидов.Эти величины ( f _ATPS , f _PGK , f _ACKr и т. Д.) Сформировали восьмиэлементный вектор, который мы использовали в качестве объясняющих переменных в пошаговой линейной регрессионный анализ. Результаты показали, что шесть фракций продукции АТФ могут объяснить 89,5% вариации фенотипического расстояния (Материалы и методы, S5 Рис.), Подтверждая предсказуемую взаимосвязь картирования между метаболическим состоянием продукции АТФ и фенотипом.

Среди этих фракций, продуцирующих АТФ, особое значение имеет f _ATPS . Тот факт, что f _ATPS положительно коррелирует с Y и отрицательно коррелирует с q _glc при каждой конкретной скорости роста (S6 рис.), Определяет его как метаболическое происхождение наблюдаемой взаимосвязи. между метаболическим состоянием и фенотипом урожайности. Наблюдаемая корреляция в основном коренится в энергетической и метаболической сети клетки, а не является простой функцией экспрессии АТФ-синтазы (S7 рис.).Интересно, что f _ATPS демонстрирует мультимодальное распределение, которое сильно коррелирует с распределением фенотипов скорости-урожайности. Решения с более высокими значениями f _ATPS (например, со средними значениями 0,71 или 0,64) расположены в пределах двух верхних гиперболических диапазонов на плоскости доходности (). Для этих высокопродуктивных фенотипов доступны данные высокого разрешения ¹³ C-метаболического потока для экспериментальной оценки их значений f _ATPS .Мы рассчитали, что f _ATPS составляет ∼0,65 для E. coli MG1655 эволюционировало в среде с минимальной глюкозой и ∼0,706 для E. coli BL21 [36], оба значения находятся в пределах 1,5% от прогнозируемых пиковых значений. с помощью нашего моделирования.

Чтобы еще раз подтвердить критическую роль f _ATPS , мы проверили, привела ли дискретность f _ATPS непосредственно к стратифицированной структуре ландшафта фенотипической пригодности.Мы выполнили моделирование выборки деформации, где f _ATPS был ограничен пятью прогнозируемыми пиковыми значениями: 0, 0,37, 0,53, 0,64 и 0,71 (материалы и методы). Результаты ясно показали, что оптимальные решения, полученные при конкретном f _ATPS , были ограничены в пределах тонкой гиперболической полосы, где q и Y были положительно коррелированы (S8 (A) Рис.). При одинаковой подаче субстрата, чем выше f _ATPS , тем выше выход биомассы, что согласуется с корреляциями, показанными на S6 (B) Рис.Этот реконструированный ландшафт приспособленности полностью воспроизводил наблюдаемое стратифицированное фенотипическое распределение.

Таким образом, мы ввели долю общего АТФ, продуцируемого АТФ-синтазой ( f _ATPS ), как простую, но эффективную количественную оценку метаболического состояния клетки и ключевой определяющий фактор для стратифицированного фенотипического распределения. на плоскости нормы доходности.

Мультимодальное распределение

Количественная взаимосвязь между f _ATPS и метаболическим и фенотипическим состоянием клетки вдохновила на исследование лежащих в основе ограничения, накладываемые на реакции производства АТФ.Чтобы установить источник этого ограничения, мы ищем систематические различия в профилях экспрессии белка между растворами с разными значениями f _ATPS . Во-первых, мы создали моделирование выборки, ограниченное шестью определенными скоростями роста при 30 ° C, чтобы ограничить неконтролируемые отклонения от температурных различий в скорости роста (Материалы и методы, S9 (A) Рис.). Результат подтвердил наблюдаемые взаимосвязи путем воспроизведения мультимодального распределения с центром в тех же значениях f _ATPS (S9 (B), рис.).

Затем мы упорядочиваем профили экспрессии смоделированных штаммов по их вычисленным значениям f _ATPS (). Мы обнаружили, что увеличение f _ATPS сопровождается переходом к более сложному протеому. Увеличение сложности протеома проявляется двояко. Во-первых, количество экспрессируемых генов увеличивается (слева). Например, пентозофосфатный путь и мультигенные белковые комплексы в окислительном фосфорилировании широко используются только при включении аэробного дыхания ( f _ATPS > 0).Во-вторых, увеличивается среднее количество субъединиц на фермент (справа). Другими словами, по мере того, как АТФ-синтаза становится ответственной за производство большей части АТФ, клетка имеет тенденцию использовать более крупные многодоменные белковые комплексы вместо моногенных ферментов с низкой молекулярной массой.

(A) Смоделированные концентрации ферментов, показанные на панели C в 368 моделированиях выборки, упорядоченные по их вычисленным значениям f _ATPS (толстая синяя сплошная линия).(B) Сложность протеома, измеренная по рассчитанному количеству экспрессируемых генов (слева) и среднему количеству субъединиц на фермент (справа) в оптимальном растворе. Оба числа увеличиваются по мере увеличения рассчитанного f _ATPS . Данные представлены в виде прямоугольных диаграмм с центральной красной линией, показывающей медианное значение, нижний и верхний края указывают 25 ^-й и 75 ^-й процентили, соответственно, и усы, простирающиеся до 1.В 5 раз больше межквартильного размаха. Неперекрывающиеся отметки на прямоугольной диаграмме показывают, что медианы между группами различаются с достоверностью 95%. Количество образцов в каждом поле указано в скобках. (C) Молекулярная масса выбранных белков и белковых комплексов, катализирующих реакции в путях продуцирования АТФ.

Переключение между моногенными и мультидоменными ферментами является наиболее очевидным в путях окислительного фосфорилирования и, в частности, в реакциях цепи переноса электронов (ETC) ().Например, восстановление хинонового пула в основном выполняется NADH-дегидрогеназой II Ndh при низком уровне f _ATPS , но переключается на более крупные белковые комплексы, такие как формиатдегидрогеназа и NADH: хиноноксидоредуктаза, как f _ATPS увеличивается. В последующем окислении хинола и транспорте протонов через внутреннюю мембрану меньший оксидазный комплекс CydABX используется при низком уровне f _ATPS , а более крупная альтернатива CyoABCD берет верх при более высоком уровне f _ATPS .Мы отмечаем, что примерно 60% реакций окислительного фосфорилирования полагаются на один или несколько белковых комплексов для катализа (таблица S1). По сравнению с другими метаболическими путями, этот высокий уровень сложности белка, вероятно, является эволюционным результатом, обеспечивающим большую гибкость и тонкую настройку для дискретного выбора стратегий производства энергии.

Эти результаты показывают сложный баланс между сложностью протеома и потребностями в энергии для роста клеток. По мере увеличения потребности в энергии для достижения более высокого выхода АТФ необходимо все больше и больше ферментных комплексов.Однако более крупные комплексы также требуют значительно больше метаболических ресурсов для их биосинтеза. Таким образом, после активации эти ферментные комплексы должны использоваться в максимально возможной степени, вызывая необходимую перестройку метаболической сети для оптимального баланса в распределении протеома и сдвигая стратегию производства АТФ к следующему дискретному состоянию.

Введение «аэротипа» как фенотипического признака, определяемого на основе

Мы показали, что аэробное дыхание через АТФ-синтазу определяет метаболическое состояние клетки и ее фенотипическое положение в зависимости от скорости выхода. самолет.Соответственно, мы определяем «аэротипы» от i до v для описания пяти популяционных фенотипов, представленных пятью пиковыми значениями f _ATPS (от f _ATPS = от 0 до f _ATPS ∼ 0,71), наблюдаемые при моделировании отбора проб деформации. Вычислительно мы сравниваем аэротип с отношением P / O, обычно используемым параметром, описывающим дыхательное поведение клеток. Мы показываем, что соотношение P / O описывает только локальную стехиометрию путей окислительного фосфорилирования.Аэротип предлагает более глобальное описание клеточной приспособленности, представляя метаболическое и фенотипическое состояние, а также сложность протеома, связанную с конкретной схемой производства энергии (S1 Text и S10 Fig). Тем не менее, необходимы экспериментальные данные, чтобы установить, что аэро-тип, определяемый с помощью вычислений, может служить практическим косвенным показателем приспособленности бактерий.

Скорость поглощения субстрата ( q ) и скорость роста ( мк ) собираются из двух основных типов экспериментальных измерений (S1 (B) Рис, вверху слева): 1) рост в хемостате питательных веществ [27, 53–57 ], и 2) характеристика конечных штаммов ALE [32, 34, 35, 37, 58–64].Затем рассчитывается выход биомассы в мккв · м, где м — молекулярная масса субстрата. В общей сложности 199 точек данных дают фенотипическое пространство, охватываемое скоростью поглощения субстрата и выходом биомассы, включая измерения, проведенные для E. coli дикого типа и штаммов с нокаутом гена (S1 (B), рис., Вверху справа), при различных питательных веществах. условиях (S1 (B), рис., внизу слева), и с различными штаммами E. coli (S1 (B), рис., внизу справа). Несмотря на большое различие в источниках данных, фенотипическая характеристика E.coli , кажется, занимает общее пространство с интересной структурой, которая обсуждается в результатах.

Обзор модели FoldME

Все моделирование выборки в этой статье выполняется с использованием недавно разработанной модели в масштабе генома для метаболизма и экспрессии белков, усиленной шаперонной сетью FoldME [33]. Реконструкция FoldME началась с связывания всех биохимических реакций в ME-Model E. coli в масштабе генома iOL 1650 [31] с последовательностями и структурами их каталитических ферментов [65].Затем мы вычислили зависящие от температуры свойства фолдинга для каждого моделированного белка, на основании чего были сформулированы требования к шаперону для конкретных условий белка. Затем мы соединили состояние сворачивания клетки с ее метаболической сетью, позволив трем путям сворачивания (спонтанному, с помощью DnaK и с помощью GroEL / ES) конкурировать за сворачивание любого белка на основе рассчитанной потребности в шаперонах. Таким образом, модель была способна регулировать путь сворачивания in vivo каждого белка, чтобы минимизировать глобальные затраты, вложенные в биосинтез шаперона, и потребность в энергии для сворачивания.

Выбор параметров имеет решающее значение для применения моделей в масштабе генома для понимания биологических явлений на системном уровне. Модель FoldME построена на основе трех основных категорий параметров: 1) глобальных физиологических параметров, 2) скорости обмена метаболических ферментов in vivo и 3) термодинамических параметров, специфичных для белков. Первые две категории параметров являются общими для всех ME-моделей, поэтому для них установлены значения по умолчанию, впервые разработанные O’Brien et al.[31]. Специфические для белков термодинамические параметры, включая скорость кинетического сворачивания, свободную энергию разворачивания и склонность к агрегации, уникальны для модели FoldME. Эти параметры рассчитываются с использованием белковых последовательностей и структур с эмпирическими алгоритмами прогнозирования, которые хорошо известны в литературе. Более подробную информацию о формулировке модели, вычислении параметров и анализе чувствительности можно найти в Chen et al. [33].

Мы показали, что модель FoldME улучшила точность и объем предсказания оптимального состава протеома при широком спектре возмущений, включая температуру, доступность питательных веществ и генетические мутации, и поэтому подходит для изучения фенотипического распределения, представленного в данном документе. бумага.

Целью нашего метода выборки является оценка фенотипического распределения E. coli с использованием штаммов in silico, реконструированных для представления разнообразия встречающихся в природе штаммов. Мы предполагаем, что адаптация достигается за счет постепенного накопления большого количества мутаций, возникающих независимо, каждая из которых оказывает незначительное случайное влияние на затронутые гены. Чтобы смоделировать последствия этого долгосрочного динамического эволюционного процесса в масштабе генома и оценить его влияние на приспособленность, мы разрабатываем двухэтапный процесс: 1) выбираем гены для мутации в соответствии с вероятностью обнаружения мутации в каждом гене, и 2) определить молекулярный эффект мутации на соответствующий ген.

На первом этапе мы проанализировали генетические вариации 1765 штаммов E. coli , собранные из 1) базы данных PATRIC [66], 2) панели штаммов Ecoref [67] и 3) вручную подобранного набора прикрепленных -инвазивный штамм E. coli (AIEC). Мы составили белковые последовательности для 1566 кодирующих белок генов, присутствующих в модели FoldME, и выполнили попарное выравнивание последовательностей белка из каждого штамма с его гомологичной последовательностью в E. coli K12 MG1655 [68].Мы обнаружили в общей сложности 266 940 мутаций кодирующей области, включая 245 635 несинонимичных SNP, 16 591 делецию и 4714 вставок. Затем мы определили вероятность обнаружения мутации в гене как количество всех наблюдаемых мутаций в этом гене по сравнению с общим количеством мутаций кодирующей области. Затем нам нужно определить, какие гены несут мутации в каждом образце. Для этого мы сгенерировали случайное число от 0 до 1 для каждого гена. Если случайное число меньше частоты мутации гена, ген мутирован; в противном случае ген остается в форме дикого типа.Таким образом, мы воспроизвели вероятность наблюдения мутации в гене в естественных штаммах E. coli (S2 Рис).

На втором этапе мы изменили каталитическую эффективность и термостабильность ферментов, выбранных для мутации на первом этапе. Было известно, что полезные и пагубные эффекты мутаций распространяются экспоненциально, с множеством мутаций с малым эффектом и меньшим количеством мутаций с большим эффектом [69, 70]. Чтобы отразить экспоненциальное распределение положительного эффекта на уровне гена, мы масштабировали скорость оборота in vivo ( k _eff ) затронутого фермента с экспоненциально распределенным случайным числом между 0.5 и 2. В то же время мы изменили термостабильность фермента (свободная энергия разворачивания Δ G ) на случайную величину от -2 до 2 ккал / моль, чтобы учесть (де) стабилизирующие мутации с небольшим эффектом. . Направление изменения эффективности и стабильности фермента считалось противоположным, учитывая плейотропные эффекты мутаций [71], так что, если эффективность фермента увеличивалась, его стабильность снижалась, и наоборот.

Наконец, чтобы представить стрессы окружающей среды, мы смоделировали 100 образцов деформации при каждой температуре от 25 до 46 ° C, в результате чего было проведено 2200 моделирования.

Чтобы проверить надежность этого процесса выборки, мы выполнили дополнительные серии моделирования со следующими модификациями: 1) зафиксировали количество мутировавших генов на 10%, 20% или 30% от общего количества смоделированных генов и выбрали мутации, предполагающие одинаковую частоту фиксации мутаций для всех генов; 2) нарушается только k _eff или стабильность ферментов, выбранных для мутации; 3) использовал другой профиль дикого типа k _eff согласно недавнему исследованию машинного обучения [72]; и 4) нарушили k _eff мутировавшего фермента с более высокими коэффициентами масштабирования.Ни одна из этих модификаций процедуры выборки не изменила наш основной вывод относительно стратифицированного фенотипического ландшафта, определяемого мультимодальным распределением f _ATPS . В качестве примера мы показали результат моделирования выборки, в котором k _eff было масштабировано от 0,1 до 10 раз и от 0,01 до 100 раз (модификация № 4, S9 (C) Fig). В обоих случаях f _ATPS распределены в тех же местах, что и на фиг. S9 (B), с различиями только в относительной амплитуде пиков приспособленности.Поэтому мы рассмотрели наш текущий выбор процедуры выборки и параметров, способных генерировать надежные фенотипические прогнозы с эволюционно значимыми генотипами.

Моделирование выборки с фиксированным

Чтобы подтвердить связь между мультимодальным распределением f _ATPS и стратифицированной структурой ландшафта фенотипической пригодности, мы выполнили моделирование выборки, где f _ATPS был ограничен пятью наиболее вероятными значениями: 0, 0.37, 0,53, 0,64 и 0,71. Ограничение было сформулировано следующим образом:

(1-п) · VATPS4rpp = p · (VPGK + VACKr + VPYK + VPPKr + VPPK2r + VSUCOAS + VPRPPS)

(1)

где V _{реакция _ имя} обозначало поток соответствующей реакции, а p было значением, которым f _ATPS было ограничено. Для каждого значения f _ATPS было выполнено 24 моделирования выборки при каждой температуре от 25 до 46 ° C.Однако это сильное ограничение вызвало множество несовместимостей с выбранным генотипом, в результате чего были получены окончательные 2237 возможных и оптимальных решений, представленных в S8 Рис.

Моделирование выборки при фиксированной скорости роста

Разница в температуре роста привела к систематическим изменениям стабильности белка и скорость оборота ферментов in vivo, следовательно, разные скорости роста [33]. Чтобы исключить возможность того, что мультимодальное распределение f _ATPS было результатом смещения, вызванного разницей в скорости роста при разных температурах, мы выполнили дополнительное моделирование выборки при одной конкретной температуре.В то же время было желательно покрыть как можно большую площадь нормы доходности. Таким образом, мы исследовали доступный диапазон q _glc и Y (то есть значения, которые предоставляют возможные решения для роста клеток) при каждой температуре в ранее описанных 2200 симуляциях выборки (S9 (A), рис.). В целом, ниже оптимальной температуры роста, доступные диапазоны q _glc и Y оба уменьшались при повышении температуры, что благоприятствовало выбору более низкой температуры.Затем мы рассмотрели совпадение с наиболее населенным диапазоном экспериментальных фенотипов (S1 (A), рис.), Где q _glc варьировались приблизительно в диапазоне от 5 до 15 ммоль / гДВт / ч и Y от 0,3 до 0,55 гДВт / г. Объединив оба критерия, мы зафиксировали второй набор моделирования выборки при 30 ° C (S9 (A) Рис, красный).

Затем, чтобы максимизировать количество экземпляров в каждом дискретном режиме f _ATPS и обеспечить прямое сравнение метаболических потоков, мы сфокусировали выборку по нескольким изоклинам μ .Мы выбрали шесть скоростей роста (значения указаны относительно скорости роста дикого растения при 37 ° C): 3 около средней скорости роста при 30 ° C (0,36, 0,44, 0,47), одна близка к верхнему пределу для роста при 30 °. C (0,65), а два чуть ниже нижней границы (0,18, 0,22). При моделировании с более высокой фиксированной скоростью роста было получено большое количество недопустимых решений, поэтому они не были включены. Результаты подтвердили, что при каждой моделируемой скорости роста f _ATPS показало аналогичное множественное гауссово распределение, которое различается только относительным весом каждого гауссова.Из-за того же количества пиков и средних значений, мы представили в S9 (B) Fig совокупный результат для всех шести темпов роста вместе.

Подгонка к мультимодальному распределению

Мы предположили, что значение f _ATPS для каждого аэротипа будет нормально распределенным. Отсюда следовало, что f _ATPS , вычисленное на основе моделирования выборки, должно быть подогнано к смеси нескольких гауссовых распределений, каждое из которых представляет один аэротип.Количество гауссовых распределений (пиков) следует выбирать как количество аэротипов, определяемых на основе различимых метаболических () и протеомных состояний (). Таким образом, мы рассматриваем f _ATPS = 0 (полностью ферментативный фенотип) как один «пик» и аппроксимируем оставшиеся данные четырьмя гауссианами с помощью Matlab.

Чтобы проверить, согласован ли наш выбор количества пиков, мы сравнили распределения, полученные из многих отдельных наборов моделирования выборки, в том числе с использованием различных стратегий выборки для анализа чувствительности.Распределение f _ATPS постоянно показывало пять пиков, хотя высота пиков варьировалась. Пики около 0,0, 0,37 и 0,53 явно присутствовали во всех наборах данных, тогда как пики около 0,64 и 0,71 могли быть размыты при определенных условиях. Эта окончательная неопределенность, вероятно, возникла из-за нерешенной протеомной сложности фенотипов с высокой степенью респираторных заболеваний, что не должно ухудшать достоверность подбора и процесса отбора проб.

Бактериальные штаммы

E.Цепь переноса электронов coli содержит два типа ферментов: дегидрогеназу, которая окисляет донор электронов, и цитохромоксидазу, которая восстанавливает акцептор электронов (S10 (A), рис.). Чтобы создать мутантные штаммы, привязанные к определенному аэротипу, мы выбираем два фермента из каждой категории, которые нужно удалить из генома: NADH-дегидрогеназа I (NuoABCDEFGHIJKLMN) и NADH-дегидроназа II (Ndh) для дегидрогеназы; цитохром bo оксидаза (CyoABCD) и цитохром bd -I оксидаза (CydAB) для цитохромоксидазы.

Три из выбранных ферментов ETC являются мультибелковыми комплексами, и мы стремимся выбрать ген, который максимально нарушает функцию всего фермента. Для НАДН-дегидрогеназы I все субъединицы необходимы для сборки или стабильности функционального фермента [73]. Субъединица, кодируемая геном nuoB , содержит кластер N2 4Fe-4S, который может играть роль в активности фермента по транслокации протонов [74]. Для цитохрома bd -I оксидазы, хотя обе субъединицы необходимы для связывания компонентов гема b ₅₉₅ и гема d цитохрома bd -I, субъединица II, кодируемая геном cydB , связывает структурную Кофактор убихинона-8, который может играть роль в сборке димера [75].Точно так же делеция каждого гена в опероне cyo приводит к нефункциональным ферментам, но мы решили разрушить cyoB , потому что он кодирует субъединицу I, которая участвует в транслокации протонов [76].

Четыре штамма с нокаутом одиночного гена ETC и четыре штамма с нокаутом двойного гена ETC были сконструированы с помощью метода трансдукции фага P1 [77] с использованием E. coli K-12 MG1655 (ATCC 700926) в качестве реципиента. напряжение. Коллекционные штаммы Keio использовали в качестве донорского штамма для создания кассет с нокаутом генов, содержащих маркер устойчивости к канамицину [78].Нокауты были подтверждены с помощью ПЦР и повторного секвенирования ДНК (таблица S3).

Характеристики были выполнены с полной аэрацией при 37 ° C в пробирках с рабочим объемом 15 мл, содержащих среду с глюкозой M9, как описано в LaCroix et al. [34]. Культуры первоначально инокулировали из замороженных запасов глицерина и выращивали в течение ночи. Физиологическая адаптация была достигнута за счет экспоненциального роста на протяжении 2 пассажей от 5 до 10 поколений. Затем культуры переносили в свежую пробирку, и показания оптической плотности (ОП) спектрофотометра периодически снимали при длине волны 600 нанометров (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) до достижения стационарной фазы.

Образцы фильтровали через фильтр 0,22 микрометра (MilliporeSigma, Burlington, MA) одновременно с измерением OD и анализом фильтрата на концентрацию глюкозы с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния). ) с колонкой Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Скорости поглощения глюкозы при экспоненциальном росте определяли с помощью наилучшей линейной регрессии концентраций глюкозы по сравнению с сухой массой клеток, умноженной на скорости роста в том же диапазоне образцов.

Скорость поглощения кислорода каждой аэробной культурой определялась путем измерения скорости истощения растворенного кислорода в закрытой камере респирометра с использованием системы биологического контроля кислорода YSI 5300A, в которой использовались полярографические кислородные зонды типа Кларк (Cole-Parmer Instruments, Vernon Hills, IL). .

Пересеквенирование ДНК

(A) Фенотипические вариации при каждой температуре. На этом графике средние значения Y и q _glc , рассчитанные для отобранных штаммов при каждой температуре, обозначены кружком, затем диапазон доступных значений обозначен горизонтальными и вертикальными линиями, проходящими через среднее . Для T = 25 ° C, 30 ° C, 37 ° C и 40 ° C для справки показан оптимальный фенотип дикого типа (квадрат). Для T = 25 ° C, 30 ° C и 40 ° C изменение предпочтительного аэродинамического типа показано разницей в распределении f _ATPS .Нарисовано восемь мк -изоклин, каждая из которых помечена относительной скоростью роста по отношению к смоделированной оптимальной скорости роста WT при 37 ° C. Распределение f _ATPS при 30 ° C наилучшим образом отражает характеристики полного распределения, поэтому мы выбираем эту температуру для последующего анализа. (B) Распределение f _ATPS из 368 симуляций выборки, выполненных при 30 ° C и выбранной скорости роста. Подгонка к смеси четырех гауссовых распределений показывает соответствие наблюдаемому стратифицированному распределению, показанному на.(C) f _{Значение ATPS} показывает аналогичное мультимодальное распределение, поскольку максимальное кратное изменение эффективности фермента увеличивается до 10 и 100 раз при моделировании выборки.

(TIF)

S10 Рис.

(A) Основные белковые комплексы, участвующие в обороте хинона при моделировании выборки. Формиатдегидрогеназа N и O катализируют одну и ту же реакцию, поэтому для простоты обозначены как один и тот же комплекс (FDN / O).График нормализованной экспрессии указанных белковых комплексов в рамке показывает различное использование фермента ETC между различными аэротипами. Чтобы сделать возможным прямое сравнение, рассчитанная массовая доля ферментных комплексов нормируется на общую массовую долю всех рибосомных белков, чтобы устранить смещение, возникающее из-за разных скоростей роста. Центральная красная линия прямоугольной диаграммы показывает медиану, нижний и верхний края указывают 25 ^-й и 75 ^-й процентили, а усы простираются до 1.В 5 раз больше межквартильного размаха. Размер выборки в каждом аэротипе такой же, как и в. (B) Активированные реакции ETC в моделировании 368 отбора проб показаны с их относительными вкладами в поток восстановления хинона и поток окисления хинола. Рассчитанный выход биомассы и выработка ацетата показаны справа, чтобы представить соответствующий смоделированный фенотип. (C) f _ATPS и соотношение P / O предварительно разделены на пять отдельных групп на основе их мультимодального распределения и сопоставлены с оптимальными решениями, показанными на панели B.(D) Сравнение экспериментальных и смоделированных относительных количеств выбранных генов ( ndh , cyoB ) по отношению к АТФ-синтазе. Длина полосы и полосы ошибок представляют собой среднее отношение и стандартное отклонение для каждого аэротипа, как определено в эксперименте и на панели C для моделирования.

(TIF)

S11 Рис.

Мутанты Δ ndh Δ cydB , Δ cydB были выбраны для представления высших аэротипов v / iv , а Δ nuoB Δ cyoB был выбран для представления мутанта. нижний аэродинамический ii .Данные роста при 30 ° C и 37 ° C точно воспроизводят ожидаемую тенденцию, так что Δ ndh Δ cydB и Δ cydB остаются в области для аэротипа iv и Δ nuoB Δ cyoB в районе для аэротипа ii . При 42 ° C все три штамма производят более низкую биомассу из-за температурного стресса. Тем не менее, они сохраняют хорошее разделение на уровне доходности, представляющем ограничения аэротипа, вызванные удалением соответствующих генов ETC.Таким образом, представленные данные подтверждают мнение о том, что дифференциальное использование генов ETC определяет фенотипический аэротип клетки.

(TIF)

S12 Рис.

(A) Схема предлагаемой иерархической стратегии производства энергии. Синие и красные стрелки соответствуют термодинамическому и дыхательно-ферментационному компромиссу соответственно. (B) Крупномасштабное представление ландшафта пригодности на плоскости доходности.Цветовой градиент указывает уровень сложности протеома, где синий представляет более простой протеом, а красный — более сложный протеом. (C) Пример адаптивной траектории во время эволюции штамма с дефицитом pgi . (D) Промежуточные эволюционные состояния были выбраны на указанных этапах и охарактеризованы на плоскости скорость-выход.