Партнёрская программа / ВСЕ ДОСКИ ОБЪЯВЛЕНИЙ
Специализированная доска объявлений о кошках: http://doska.cat/
Универсальная доска объявлений: http://doska.click/
Специализированная доска объявлений о собаках: http://doska.dog/
Специализированная доска объявлений о живописи: http://doska.gallery/
Универсальная доска объявлений: http://doska.link/
Любимая доска объявлений: http://doska.love/
Специализированная доска объявлений о деньгах, бонистике, нумизматике и коллекционировании http://doska.money/
Именная доска бесплатных объявлений: http://doska.name/
Первая доска бесплатных объявлений: http://doska.one/
Универсальная доска бесплатных объявлений: http://doska.sale/
Универсальная доска бесплатных объявлений: http://doska.xyz/
Универсальная доска бесплатных объявлений: http://kupi-prodai.
site/
Универсальная доска бесплатных объявлений: http://obyavlenie.site/
Универсальная доска бесплатных объявлений: http://obyavlenie.space/
Рекламная доска бесплатных объявлений: http://reklamnaya.com/
Специализированный юридический портал бесплатных объявлений, каталог документов: http://bir-doc.com/
Универсальная доска бесплатных объявлений: http://искать-здесь.рф/
Универсальная доска бесплатных объявлений: http://подать-объявления.рф/
Универсальная доска бесплатных объявлений: http://doski.site/
Специализированная доска бесплатных объявлений о работе: http://doska.work/
Популярные запросы по словосочетанию «ДОСКА ОБЪЯВЛЕНИЙ» по статистики поисковика Яндекс: доска объявлений, доска бесплатных объявлений, авито доска объявлений, авито доска бесплатных объявлений, доски ру объявления, доска объявлений красноярск, доска объявлений работа, гей доска объявлений, доски объявлений области, доске объявлений ru, доска объявлений вакансии, доска объявлений томск, доска объявлений бор, доска частных объявлений, доска объявлений сосновый, доска объявлений работа вакансии, доска объявлений воронеж, доска объявлений москва, доска объявлений куплю, камелот доска объявлений, +весь сосновый бор доска объявления, авито томск доска объявлений, 24 доска объявлений, авито томск доска бесплатных объявлений, гатчина доска объявлений, доска объявлений камелот воронеж, авто доска объявлений, камелот доска объявлений вакансии, доска объявлений воронежа вакансии, доска объявлений знакомства, вакансии +в воронеже камелот доска объявлений, камелот доска объявлений работа, авито красноярск доска объявлений, доска объявлений работа воронеж, работа +в воронеже камелот доска объявлений, работа камелот доска объявлений вакансии, доска объявлений пикалево, работа +в воронеже доска объявлений вакансии, работа +в воронеже камелот доска объявлений вакансии, 24 ру доска объявлений, доска объявлений продажа, 24 красноярск доска объявлений, 24 ру красноярск доска объявлений, доска объявлений новосибирск, онлайн доска объявлений, доска объявлений якт, доска объявлений 999, доска объявлений новгород, md доска объявлений, 999 md доска объявлений, доска объявлений россия, 24 авто доска объявлений, 24авто доска объявлений, доска объявлений лесосибирск, доска объявлений +от частных лиц, 24авто красноярск доска объявлений, доска объявлений ростов, доска объявлений тихвин, доски объявлений нижний, чепецк ру доска объявлений, доски бесплатных объявлений новгород, якт ру доска объявлений, доска объявлений красноярск авто, 24авто ру доска объявлений, доска объявлений нижний новгород, зерно доска объявлений, доска объявлений ростов +на дону, авто ру доска объявлений, 24авто ру доска объявлений +в красноярске, доска бесплатных объявлений нижнем, доска объявлений алексеевка, бесплатные доски объявлений нижний новгород, зерно онлайн доска объявлений, доска бесплатных объявлений ростов, авто ру доска объявлений красноярске, доска объявлений якутск, доска объявлений 24 авто ру, сайт доска объявлений, доски объявлений ростова +на дону бесплатные объявления, доска бесплатных частных объявлений, 24 авто красноярск доска объявлений, qrz доска объявлений, qrz ru доска объявлений, доска частных объявлений авито, доска объявлений купить бесплатно, доска объявлений г, югс доска объявлений, 24 авто ру красноярск доска объявлений, юла доска объявлений, доска объявлений недвижимость, доски ру бесплатные объявления, доска бесплатных объявлений +от частных лиц, доска объявлений калуга, гей знакомства доска объявлений, авито доска объявления ростов, раменское доска объявлений, раменская доска объявлений, авито ростов доска бесплатных объявлений, авито ростов +на дону доска бесплатных объявлений, югс доска бесплатных объявлений, доска объявлений московский, калуга доска бесплатных объявлений, доска бесплатных объявлений москва, доска объявлений авито нижний, доска объявлений радиолюбителей, авито доска объявлений +от частных лиц, ростовская доска объявлений, мореход доска объявлений, авито нижний новгород доска объявлений, доска объявлений +из рук +в руки, авито нижний новгород доска бесплатных объявлений, объявления якутск доска якт, лыткарино доска объявлений, qrz ru доска объявлений радиолюбителей, якт ру доска объявлений якутск, доска секс объявлений, доска объявлений продажа авто, доска объявлений города, мореход ру доска объявлений, авито доска бесплатных объявлений +от частных, доска объявлений без, 624600 доска объявлений, доска объявлений алапаевск, авито доска бесплатных объявлений +от частных лиц, доска объявлений слон, купля доска объявлений, куплю слона доска объявлений, продажа авто красноярске доска объявление, купи слона доска бесплатных объявлений, куплю слона доска объявлений калуге, купи слона калуга доска бесплатных объявлений, 624600 доска объявлений алапаевск, доска объявлений московская область, доска объявлений спб, доска объявлений нарьян, доска объявлений авито ру, доска объявлений ростовская область, ростовская доска бесплатных объявлений, продам доску объявлений, доска объявлений +в контакте, доска бесплатных объявлений ростовской области, доска объявлений бокситогорск, ростовская доска объявлений авито, авито ростовская область доска объявлений, популярные доски объявлений, доски объявлений без регистрации, 24 ау ру доска объявлений, авито ростовская область доска бесплатных объявлений, красноярская доска объявлений, агросервер доска объявлений, московские доски объявлений бесплатно, доски объявления москва московская, доска объявлений района, доска объявлений красноярский край, доска объявлений чита, доска объявлений рубцовск, доска объявлений лабинск, белгородская доска объявлений, доска объявлений одноклассники, авито рубцовск доска объявлений, бесплатная доска объявлений рубцовске, авито рубцовск доска бесплатных объявлений, ау красноярск доска объявлений, 24 ау красноярск доска объявлений, доска объявлений барнаул, доска объявлений юрга, ау ру красноярск доска объявлений, 24 ау ру красноярск доска объявлений, доска бесплатных объявлений без, доска объявлений еманжелинск, 24 доска объявлений продажа авто, доска объявлений петербург, нижегородские доски объявлений, доски объявлений нижегородской области, бесплатные доски объявлений без регистрации, бесплатные доска объявлений москва область, доска бесплатных объявлений москва московская, работа +в гатчине доска объявлений, доска объявлений кемерово, продажа авто авто ру 24 доска объявлений, 24 авто красноярск продажа авто доска объявлений, доска объявлений компаний, б доска объявлений, 999 доска объявлений молдове, доска объявлений +в молдове, нижегородская доска бесплатных объявлений, доска объявлений канск, md доска объявлений молдове, 999 md доска объявлений +в молдове, доска объявлений москва +и московская область, главная доска объявлений, свежие доски объявлений, доска объявлений авито нижегородская область, авито нижегородская область доска бесплатных объявлений, доска объявлений краснодар, авто 24 ру красноярск доска объявлений продажа, доска объявлений квартир, доска объявлений санкт, доска объявлений санкт петербург, доска объявлений пенза, доска бесплатных объявлений канск, доска объявлений +от частных лиц +и компаний, доска объявлений avito, доска бесплатных объявлений юрга, урбето доска объявлений, нарьян март доска объявление, нарьян март ру доска объявлений, доска объявления авито канск, бесплатные доски объявлений +по россии, авито канск доска бесплатных объявлений, доска объявлений арзамас, урбето +весь еманжелинск доска объявлений, блюсистем доска объявлений, воронежские доски объявлений, авито ру доска бесплатных объявлений, доска объявлений омск, доска ru бесплатных объявлений, форум доска объявлений, доска объявлений новосибирск частные объявления, свежие вакансии доска объявления, доска объявлений белгородская область, доска объявлений воронежская область, лесосибирск главная доска объявлений, доска бесплатных объявлений барнаул, доски объявлений рб, доска объявлений сергиев посад, бесплатные доски объявлений москва +и московская область, русская доска объявлений, доска объявлений екатеринбург, +из рук +в руки доска бесплатных объявлений, бесплатные доски объявлений сергиев посад, новая доска объявлений, 24auto ru доска объявлений, доска бесплатных объявлений арзамасе, благ доска объявлений, авито арзамас доска объявлений, объявления королева доска объявлений королев, доска объявлений королев, авито арзамас доска бесплатных объявлений, доска бесплатных объявлений кемерово, авито сергиев посад доска объявлений, вакансии +в гатчине доска объявлений гатчина, авито сергиев посад доска бесплатных объявлений, доска бесплатных объявлений урюпинск, доска объявлений цена, доска объявлений авито продажа, доска объявлений самара, авито кемерово доска объявлений, доска объявлений алексеевка белгородская область, авито воронежская область доска объявлений.
..
Популярные запросы по словосочетанию «ОБЪЯВЛЕНИЯ» по статистики поисковика Яндекс: 24 авто объявления, дром ру краснодарский край авто объявления, объявления, расклейщик объявлений, частные объявления, доска объявлений бор, авито бесплатные объявления, суть объявления, юла объявления, авито московская авто пробегом частные объявления, объявления авто +с пробегом, челябинские объявления, объявления ру, отдам даром москва свежие объявления, объявления +на авито, доска частных объявлений, объявления спб, авито москва московская объявления, сайт объявлений, авито объявления мебель, подам объявление, бесплатные объявления новосибирск, подавать объявление, объявления киров, объявления москва, доска объявлений сосновый, авито объявления спб, бесплатные объявления отдам даром, авито пробегом частные объявления, частные объявления б, авито авто +с пробегом частные объявления, объявления куплю дом, объявления куплю, авито +мои объявления личный, юле сайт объявлений, доска объявлений работа вакансии, объявления воронеж, авито +мой кабинет +мои объявления, авито доска объявлений, авито личный кабинет +мои объявления, объявления недвижимость, доска объявлений воронеж, подай бесплатное объявление, бесплатные объявления авита, частные объявления москва, бесплатные объявления авит, сайт бесплатных объявлений, частные объявления россия, авито доска бесплатных объявлений, авита ру бесплатные объявления, авто ру объявления, авит ру бесплатные объявления, бесплатные объявления ru, объявления массажисток, юла сайт бесплатные объявления, объявления гатчина, avito ru объявления, объявления бу москва, авто ру авто +с пробегом частные объявления, авито москва +и московская область частные объявления, avito ru бесплатные объявления, номер газеты объявлений, объявления омск, объявления авито новгороде, объявления екатеринбург, авито объявления б, камелот объявления, объявления казань, частные объявления куплю, якт объявления, камелот воронеж объявления, камелот объявления работа, дам объявление, объявления симферополь, даю объявление, барахолка объявления, данное объявление, объявления няня, юла объявления официальный, объявления +на авито без регистрации, номер объявления, объявления +в московском, гей объявления, массажистка частные объявления, авто объявления москва, читать объявления, авито омск объявления, частные объявления екатеринбург, объявления даром, расклейка объявлений, подам объявление +на авито, камелот воронеж объявления работа, домофонд объявления, объявления старого, юла бесплатные объявления официальный, бесплатные объявления россия, домофонд недвижимость объявления, объявление +о продаже квартиры, объявления посредника, +с пробегом +в москве частные объявления, авито воронеж объявления, размещение объявлений, объявления отдам даром, объявления сдам, дром частные объявления, объявления тула, объявление дроме авто пробегом, объявления сады, объявления г, подать объявление +о продаже, разместить объявление, частник объявление, новгород объявления, объявления иванова, газета бесплатных объявлений, хибины объявления, новые объявления, +моя реклама объявления, регистрация объявлений, объявления требуется, объявления без регистрации, бесплатные объявления +на авито регистрация, объявления нижний новгород, объявления машин, частные объявления москве области, доска объявлений москва, объявления продам, бесплатные объявления +о продаже, б +у объявления, объявления калининград, объявления чита, частные объявления петербург, бесплатные объявления регистрацией, объявления оренбург, мужчин частные объявления, доска объявлений куплю, бесплатные объявления без регистрации, объявления липецк, доска объявлений красноярск, бесплатные объявления самара, объявление петербурге, орск ру объявления, частные объявления москва московская область, воронеж вакансии объявление, авито москва +с пробегом частные объявления, объявления ярославль, объявления москве авто авито, частные объявление санкт, объявления самара, объявления без посредников москва, авито авто частные объявления москва, интернет объявления, авито москва авто пробегом объявления, объявления архангельска, свежие объявления +на авито, объявления авто пробегом россия, авито москва авто +с пробегом частные объявления, частные объявления санкт петербург, дром ру авто частные объявления, объявления тихвин, московские объявления авто, объявления брянск, объявления крыма, камелот доска объявлений, частные объявления московская область авто, +весь сосновый бор доска объявления, ярмарка объявления, объявления работа свежие вакансии, объявления телефон, ростовские объявления, дам бесплатное объявление, частные объявления авто россии, купить авто частные объявления, смешные объявления +на авито, свежие объявления без посредников, вакансии объявлениях камелот, объявления куплю москва, объявления белгород, объявление купить авто пробегом, авто россия авто +с пробегом частные объявления, московская область авто пробегом частные объявления, объявления сургут, бесплатные объявления области, няня частные объявления, дар даром свежие объявления, авито объявления +от частных лиц, объявления +о работе, бесплатное объявление квартир, объявления новокузнецк, авито томск доска объявлений, объявления куплю +на авито, 24 доска объявлений, образец объявления, авито томск доска бесплатных объявлений, частные объявления спб, 2 2 объявления, авто объявления краснодарский край, камелот воронеж объявления вакансии, объявления челябинск, бесплатные объявления красноярск, объявления куплю квартиру, бесплатные объявления петербург, +из рук +в руки бесплатные объявления, смотреть объявления, объявления саратов, гатчина доска объявлений, объявления москве даром, объявления тольятти, объявление года, объявления +о сдаче, аренда объявления, авто объявления нижнем новгороде, свежие объявления вакансии, доска объявлений камелот воронеж, объявления +от частных лиц, газета свежие объявления, гей доска объявлений, бесплатные объявления санкт, бирге ру объявление, частный дом объявления, авито авто +с пробегом частные объявления купить, авито ру объявления авто, можно объявление, объявления работодателей, личные объявления, нижний новгород авто +с пробегом частные объявления, доски объявлений области, объявления +в пензе, авито ру бесплатные объявления, объявление строки, подам объявления без регистрации, самые объявления, найти объявление, вдв объявления, авито ру частные объявления, объявления пикалево, рязань свежий номер последние объявления, объявления девушек, объявления отдам даром москва, частник междуреченск объявления, авто объявления россия, правильное объявление, объявления автомобилей, объявления сегодня, ярмарка свежие объявления, камелот воронеж объявления работа вакансии, подать объявление бесплатно без, авто доска объявлений, разместить объявление бесплатно, объявления авито ру авто пробегом, московские объявления недвижимость, камелот доска объявлений вакансии, ярмарка рязань свежие объявления, доска объявлений воронежа вакансии, объявления уфа, объявления бегущей, авито объявления даром, объявления ингушетии, объявления недвижимости московская область, доска объявлений знакомства, бесплатные объявления новгород, частник м объявления, +как подавать объявления +на авито, подам объявление газету, объявления улан удэ, посмотреть объявления, где объявления, подать объявление авито без, домофонд недвижимость объявления московская, частник м междуреченск объявления, объявления авито московской, объявление +в детском саду, купить квартиру свежие объявления, павловские объявления, домофонд недвижимость объявления московская область, объявления вологда, дару дар москва свежие объявления, объявления бегущей строки, бесплатные частные объявления, рекламное объявление, бесплатные объявления нижний, объявления чайковский, объявления кабинет, вакансии +в воронеже камелот доска объявлений, авито работа свежие объявления, авито тюмень объявления, частное объявление без посредников, камелот доска объявлений работа, объявление 24, авито красноярск доска объявлений, объявления комсомольск, доска объявлений работа воронеж, авто ру краснодарский край объявления, регистрация авито подать объявление, бор объявления, авто ru объявления, объявления собак, +как подавать объявление +на авито бесплатно, частные объявления нижнем, бесплатные объявления воронеж, дром краснодарский край объявления, объявления ростовской области, дром краснодарский край частные объявления, частные объявления челябинской области, авито авто москва области частные объявления, свежие объявления сниму, юла бесплатные объявления спб, объявления ульяновск, личный кабинет +мои объявления, авто объявления челябинская область, объявления междуреченск, объявления кургана, объявления авит, шаблон объявления, даю объявление +на авито, бесплатные объявления куплю, сосновый объявления, челябинская область авто +с пробегом частные объявления, объявления +на авито квартиры, объявления хабаровск, авито авто объявление московски область, газета +из рук +в руки объявления, авита ру объявления, авито улан удэ объявления, дром ру краснодарский край частные объявления, объявления лесосибирск, объявления барнаул, работа +в воронеже камелот доска объявлений, доска объявлений, авито ру авто +с пробегом частные объявления, частные объявления авто, объявления без посредников работе, авто +с пробегом частные объявления, подача объявлений, объявления область, авто +в москве частные объявления, подать объявление, www объявления, авито объявления авто, работа камелот доска объявлений вакансии, авито авто частные объявления, скачать объявления, газета объявлений, доска объявлений пикалево, объявления ru, работа +в воронеже доска объявлений вакансии, подам объявление бесплатно, объявления сниму без посредника, объявления квартиры, юла объявления екатеринбург, объявления новосибирск, авито объявления +о продаже, avito объявления, сайт объявлений москва, объявления +о продаже, 24 ру объявления, авито область авто пробегом частные объявления, дать объявление +на авито бесплатно, массаж частные объявления, тв объявления, объявления официальный сайт, курьер объявления, объявление дали, юла бесплатные объявления отдам, объявления +из рук +в руки, объявления шины, юла объявления официальный сайт, юла объявления отдам даром, дром объявления, объявления ваз, подать объявление +на авито, частные объявления самара, бесплатные объявления официальный сайт, работа +в воронеже камелот доска объявлений вакансии, юла бесплатные объявления официальный сайт, объявления +о несостоятельности, последние объявления, объявления ижевск, бесплатные объявления ру, частные объявления квартир, дром авто +с пробегом частные объявления, лучшие объявления, объявления москвы +и области, 24 ру доска объявлений, авито москва частные объявления, объявления орлов, объявления москвы +и московской области, объявления орел, свежие объявление квартира, авто объявления красноярск, частные объявления московском, объявления кострома, частные объявления московская область, ваши объявления, подать объявление +на авито бесплатно, разместить объявление +на авито, массаж +для мужчин объявления, частные объявления ищу, сахком объявления, объявления авито г, объявления санкт, объявления владивосток, объявления краснодарский край, доска объявлений продажа, дром ру частные объявления, объявления великие, дром ру авто +с пробегом частные объявления, объявления якутск, доска объявлений работа, подать объявление авито бесплатно без, объявления тюмень, юла новосибирск объявления, объявление фото, белгородское объявление, онлайн объявления, объявления жилья, детские объявления, ярмарка газета объявлений, частные объявления краснодарский край, авито частные бесплатные объявления, куплю авто +с пробегом частные объявления, объявления курск, москва свежие объявления, текст объявления, краснодарский край авто +с пробегом частные объявления, красноярск объявления 24, интим объявления, юла бесплатные объявления отдам даром, куплю москва частные объявления, бесплатные объявления калуга, объявления краснодар, объявление сайт ру, подать объявления регистрация, объявления таганрог, бирге объявление, авито краснодарский край частные объявления, объявления ам, объявления оскол, авито объявления недвижимость, дать объявление без регистрации, подать объявление без регистрации, примеры объявлений, объявления ростов +на дону, объявления тверь, доска объявлений вакансии, объявления авито дом, ам ру частные объявления, 24 красноярск доска объявлений, объявления авто ам ру, объявление ли, ам ру авто +с пробегом частные объявления, входе объявление, ярмарка рязань объявления свежий номер, www объявления ru, +как написать объявление, подам объявление рук руки, объявления улан, объявления вещей, подам объявления без регистрации бесплатно, юла самара объявления, авто ру пробегом москве объявление, якт ру объявления, авто ру москва +с пробегом частные объявления, объявления отдам мебель, авито чита объявления, бесплатные объявления ростов, объявления сниму квартиру, частные объявления знакомства, объявления отдам бесплатно, объявления астрахань, объявления +в контакте, коммерсант объявления, воронеж объявления работа, объявления чебоксары, объявления цена, юла самара бесплатные объявления, объявления комсомольск +на амуре, купить дом свежие объявления, юла объявления спб, юла москва объявления, частные объявления нижний новгород, беркат объявление, авита объявлений, объявления старый оскол, бесплатные объявления дар, сайт объявлений самара, объявления сосновый бор, миасс объявления, объявления выпуск газеты, подать объявление +из рук +в руки, авто объявления, недвижимость объявления москва, юла бесплатные объявления, продать объявления бесплатно, свежие объявления, юла бесплатные объявления новосибирск, доска бесплатных объявлений, дать объявление бесплатно без, частные объявления область, массаж частные объявления +в спб, область авто пробегом частные объявления, подавать объявления авито бесплатно без регистрации, авто ру частные объявления, авито подать объявление бесплатно без регистрации, массаж объявления, объявления красноярск 24 ру, авито новосибирск объявления, объявления севастополя, объявления московская область, частные объявления воронеж, объявления домов, сколько объявлений, доски ру объявления, объявления кузнецк, подам бесплатное объявление авито, авито россия частные объявления, объявления нижняя, последние объявления работе, объявления знакомства, сайт бесплатных объявлений самара, секс объявления, пробегом бесплатные объявления, объявления рязань, дать объявление бесплатно без регистрации, массаж +для мужчин частные объявления, дам объявление бесплатно без регистрации, объявления санкт петербург, 4 объявления, объявления сниму, авито ростов объявления, района объявления, 24 ру красноярск доска объявлений, частные объявления бу, объявление 3, частные объявления +на авито, авито объявления вакансии, объявления 2016, объявления отдам даром мебель, объявление авито купить авто, объявлений свежем номере газеты, свежие объявления рязани, воронежские объявления, дам объявления авито, авито авто пробегом объявления россия, авто ру москва частные объявления, объявления продажи россии, бесплатные объявления авто, юла сайт объявлений самара, ярмарка объявления рязань, объявления товарах, посредник объявления квартиры, бесплатные объявления ростов +на дону, регистрация объявления авито, массаж объявления москва, чепецк ру объявления, сайт юла бесплатные объявления самара, объявления орск, объявления череповец, смешные объявления, санкт петербург ру объявления, объявления пермь, бесплатные объявления официальный сайт самара, одноклассники объявления, доска объявлений новосибирск, дром краснодарский край частные объявления +с пробегом, частные объявления +о продаже, объявления калуга, объявления благовещенск, поиск объявлений, юла бесплатные объявления официальный сайт самара, бесплатные объявления, авито авто бесплатные объявления, бесплатные объявления спб, красноярские объявления, юла сайт объявлений, сайт объявлений города, объявление без, воронеж объявления недвижимости, официальное объявление, бесплатные объявления чайковский, объявления красноярск, нижегородские объявления, объявления без посредников, ингушетия ру объявления, бу объявления, онлайн доска объявлений, объявления чит, бесплатные объявления +в москве, краснодарские объявления, частные объявления +из рук +в руки, авито екатеринбург объявления, губерния объявления, москва ру объявления, объявления алексеевка, объявления мебель, объявление челнов, подать объявление без, объявления про, доске объявлений ru, авито россия авто частные объявления, ру объявления красноярск, объявление 999, ярмарка рязань свежий номер последние объявления, авито россия авто +с пробегом частные объявления, объявления ставрополь, базар объявления, авито объявления отдам даром, доска объявлений якт, яндекс объявления, свежие объявления авто, доска объявлений томск, подать объявление +в газету, авито спб бесплатные объявления, объявления сочи, avito бесплатные объявления, ингушетия объявление беркат, объявления отдам, объявления красноярский край, объявления россия, доска объявлений 999, купить пробегом частные объявления, бесплатные объявления екатеринбург, объявления ростов, объявления +о продаже авто, объявление авто ру москва, объявление md, объявления квартир без посредников, массаж частные объявления москва, дома свежие объявления, доска объявлений новгород, дать объявление +на авито, md доска объявлений, подать объявление бесплатно, объявления авито амуре, авито ру объявления, группы объявлений, дать объявление бесплатно, авито объявления комсомольск, объявления комнаты, ставропольские объявления, объявление день, авито фото объявление, отдам даром свежие объявления, частные объявления новгороде, пробегом частные объявления, купить авто объявления, архангельск губерния объявления, 999 md объявления, объявления работа +в москве, дать объявление
тепловизор для охоты
| Главная » ВИДЕОНАБЛЮДЕНИЕ » ТЕПЛОВИЗОРЫ |
Отзывы о продукте
Отзывы о продукте FLIR Systems PathFindIR (8,3 Гц PAL / 7,5 Гц NTCS) тепловизор для охоты
порно двойной анал жестко
StevenSeD
(05.
06.2022 12:53:11)
порно кроссдрессеров скачать https://ebunovo.online/ смотреть порно молодые в чулках
домашнее порно видео 40 [url=https://ebunovo.online/search/%D0%92%20%D1%87%D1%83%D0%BB%D0%BA%D0%B0%D1%85
/]секс чулках целки [/url]
[url=http://sofiya.kiev.ua/forum-dymokhodov/dymokhody/2179-smotret-porno-sem
ya.html]смотреть порно семья[/url]
[url=http://put-right.pornoautor.com/site-announcements/1211433/hot-teen-pic
s?page=65#post-6276852]русское порно онлайн в качестве[/url]
921]порно ролики сыновьями скачать[/url]
[url=https://inaeskk.com/pages/3/step=confirm/b_id=7/r_id=1/fid=09dd5c075660
809f96d07fbb3442f495]порно маленькими девушками бесплатно[/url]
[url=https://anserch.ne.jp/pages/3/step=confirm/b_id=7/r_id=4/fid=ddc4f16eff
e4a6f9f7ebfaf93ce01537]порно кино смотреть онлайн[/url]
[url=http://www.
bsbi.co.uk/Trusted-only-people/viewtopic.php?f=11&t=431016]узбекские девушки порно[/url]
[url=http://nsg-spb.ru/vse_novosti/asfaltirovanie_po_specialnoj_cene/]пор
но большие высокие[/url]
[url=https://kitchenbathroomcreations.com/lastra-kitchen/#comment-2771]кр
сивое рус порно[/url]
[url=https://www.nantes-daytrips.com/hello-world/#comment-330870]порно эротика смотреть онлайн[/url]
[url=https://raqmiyat.com/reseller-me-forum-and-excellence-awards-2020/#comm
ent-42561]смотреть бесплатно порно актрисы[/url]
018a7ce
смотреть порно 2020
DerekAccom (05.06.2022 12:21:07)
смотреть порно видео брат https://pornovip.club/ порно молодых 18 лет
[url=https://pornovip.club/search/%D0%92%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D1%81%D0%B0%D1%82
%D1%8B%D0%B5/]порно волосатых зрелые с формами [/url]
[url=http://www.krisenkueche.de/statt-kuchen-waffeln/#comment-44272]секс порно молодых дам[/url]
[url=https://singaporegid.
ru/viza-v-singapore-online.html]смотреть порно зрелых блондинок[/url]
[url=https://keosko.com/how-to-achieve-success-with-a-digital-campaign/#comm
ent-79]русское порно анал дочки[/url]
[url=https://www.jamshedpurcakedelivery.com/index.php/2021/07/31/hello-world
/#comment-7922]порно секси молодые[/url]
19a03c9104c]смотреть порно анал попки[/url]
[url=http://ppi.net.ua/index.php/informatsiya/privitannya]хороший порно красивых женщин[/url]
[url=https://mwsn.in/media-coverage/single/REJQMExVRkl5OTI0U3k5OUZEcHFTUT09/
#comments]скачать деревенское порно[/url]
[url=https://mxdeal.com/all-topics/topic/%d0%bf%d0%be%d1%80%d0%bd%d0%be-%d0%
be%d0%bd%d0%bb%d0%b0%d0%b9%d0%bd-%d1%81-%d1%80%d1%83%d1%81%d1%81%d0%ba%d0%b8%d0%
bc-%d0%bf%d0%b5%d1%80%d0%b5%d0%b2%d0%be%d0%b4%d0%be%d0%bc/#postid-344991]пор
о онлайн с русским переводом[/url]
[url=https://www.
weavingcultures.com/the-culturally-competent-interpreter/#comment-35600]порно русскую ебут большим[/url]
[url=http://polimer42.ru/communication/forum/messages/forum3/topic3176/messa
ge27519/?result=new]порно большие молодые девки[/url]
87018a7
Rizk planira vas upoznati s ugodnim aspektima
Jerryguity (05.06.2022 09:06:59)
Naglasak je na zabavi i zabavi u Rizk online casinu, a svjezi dizajn stranice odrazava mladenacki i energican osjecaj ove stranice za online igre. Za razliku od nekih zagusljivih i formalnijih online https://626a903d10894.site123.me/blog/rizk-casino-pregled kockarnica koje mozete pronaci, kapetan Rizk planira vas upoznati s ugodnim aspektima online igranja.
[url=https://www.beefashioncollection.net/profile/casino-games-gambling-scan
dinavia/profile]like this[/url]
[url=www.google.com/travel/trips/s/UgxR8DIxa7YCefutHgx4AaABLKgBis6YCA]live blog[/url]
[url=https://www.kneadcommunitycafe.
org/profile/top-tips-to-getting-best-onl
ine-casino-bonus-deal/profile]here she is[/url]
s/profile]like this[/url]
[url=https://steveonlinepregledniblok.blogspot.com/2022/05/najbolje-kazino-i
gre-za-isprobajte.html]this[/url]
Dirty Porn Photos, daily updated galleries
arlenekr2 (04.06.2022 20:17:34)
Dirty Porn Photos, daily updated galleries
http://bilufilmphoto.bestsexyblog.com/?jalynn
mother and young son porn ipod bust it now free streaming porn ladyboy transexual free high quality porn picture galleries old young hardcore porn hd mpeg video downloads porn
סקס
AnnieFeaKe (04.06.2022 17:19:11)
סקס
[url=»https://hackernoon.com/u/pattersonolivia777″]https://hackernoon.
com/u/pattersonolivia777[/url]
Деньги в долг на карту в Волгограде
zaymSkich
(04.
06.2022 14:07:31)
[url=https://kreditnakartu.info/]Микрозаймы онлайн на карту в Архангельске[/url]|
Займ денег в Омске
Получить срочный займ в Ижевске
Займ круглосуточно в Иркутске
<a href=https://kreditnakartu.info/>Займ на год на карту срочно в Москве</a>|
купить илсира
Duanegause (04.06.2022 10:22:06)
[url=https://xn—-7sbbajqthmir8bngi.xn--p1ai]сурфактант купить[/url] — актемра80 продать, сарилумаб цена
Ranorex Studio torrent
Antoinehah (04.06.2022 09:48:39)
[url=https://softoroom.org/topic72858.html]EximiousSoft Banner Maker Pro torrent[/url] — скачать ColorMania, MathType full
Сигареты электронные
Conradseerb (04.06.2022 08:31:39)
[url=https://t.me/s/sigaretyoptom24]Купить сигареты[/url] — Электронные сигареты купить, Купить чапман
порно девушка на спине
JefferyMus
(04.
секс порно зрелые смотреть бесплатно [url=https://mobajlporno.online/]Мобайл порно[/url] порно русских женщин онлайн
порно втроем смотреть онлайн [url=https://mobajlporno.online/categories/%D0%91%D0%BB%D0%BE%D0%BD%D0%B4%D0%B8%
D0%BD%D0%BA%D0%B8/]видео порно блондинка оргазм [/url]
[url=https://escuelaliving.com/el-primer-paso-donde-estudiar-coaching-en-col
ombia/#comment-86854]смотреть бесплатно красивое русское порно[/url]
[url=https://www.maruyagym.com/publics/index/5/b_id=9/r_id=1/fid=b8c55146038
b76165c55fc295d4381eb]смотреть порно с большими красивыми девушками[/url]
[url=http://kristenanna.com/index.php/2019/04/11/the-secret-ive-been-keeping
/#comment-13734]секс порно русский больший сиськи[/url]
[url=https://ladour2007.blog.ss-blog.jp/2022-03-18?comment_success=2022-06-0
[url=https://shlyapuncel.
com.ua/products/-shapochka-dlya-malchika-shl#comment_47202]порно актрисы скачать бесплатно[/url]
[url=https://www.nitessatun.net/journal/index.php?topic=54646.new#new]пор
но губы девушки[/url]
[url=https://signyou.de/morbi-vitae-dui-euismod-vulputate-sollicitudin/#comm
ent-168433]русское порно зрелых новое[/url]
[url=https://bluestarmomssew.com/apps/blog/show/45912154-bsm-brochure-/]се
кс порно анал жестко[/url]
[url=https://bar-instant.com/cocktail-dinatoire/?cf_er=_cf_process_629a71839
c23f]смотреть порно секс видео молодыми[/url]
[url=https://www.taiki-jp.com/publics/index/5/step=confirm/b_id=9/r_id=1/fid
=9cb3698c278d88a786004c8cd72fadbb]красивое домашнее порно зрелых[/url]
4d8_e1c
<< пред 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 след >>
Написать отзыв
Объявления ПОПУТЧИКОВ на портале Попутчики.
ру ®Tatyana 0 лет, Архангельск
Опубликовано 07.10.2022 в 23:59
Казань 13-17 октября, автобусный тур из Архангельска
Татарстан
Даты: —
На чем: автобус
Цель: Путешествия
Оплата: другое Самостоятельная оплата
Вячеслав 26 лет, Крым
Опубликовано 07.10.2022 в 23:44
Туда 17, обратно 21-22
Крым
Санкт-Петербург Всеволожск
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: договоримся
Максим 43 года, Новая МоскваОпубликовано 07.10.2022 в 22:45
Путишествие.
Новая Москва
Сочи
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: приглашу в гости
Роман 36 лет, Краснодар
Опубликовано 07.10.2022 в 21:45
Приятное времяпровождение
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Я довезу Знакомства Путешествия Отдых
Оплата: оплачу поездку
Ильмира 32 года, Уфа
Опубликовано 07.10.2022 в 21:42
Найти тур в Турцию или только отель — подешевле))
Уфа
Турция
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Наталья 35 лет, Крым
Опубликовано 07.
10.2022 в 21:37
Новые знакомства, общение, расширения круга друзей
Даты: —
На чем: машина турпутевка автобус
Цель: Знакомства Путешествия Прогулки Культура Поход
Оплата: пополам другое
Эля 36 лет, Москва
Опубликовано 07.10.2022 в 19:57
Мне 36 лет, Лечу с дочкой (8 лет),ищем компанию так же де…
Москва Минск
Египет
Даты: —
На чем: турпутевка
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Ксения 34 года, Кострома
Опубликовано 07.10.2022 в 19:46
Для компании, удешевления поездки
Зимбабве Южно-Африканская Республика
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Марат 39 лет, Москва
Опубликовано 07.10.2022 в 19:25
Доехать из одного города до другого
Уфа
Москва
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: договоримся
Николай 34 года, Бугульма
Опубликовано 07.10.2022 в 16:58
Добраться до работы
Бугульма
Даты: —
На чем: попутка
Цель: Нужна машина-попутка Путешествия
Оплата: договоримся
Светлана 54 года, Екатеринбург
Опубликовано 07.
10.2022 в 16:44
Нужно доставить синтезатор. Вес 17 кг. длина коробки 146 см.
Екатеринбург
Нижний Тагил
Даты: —
На чем: попутка машина
Цель: Доставка
Оплата: оплачу поездку
Севда 28 лет, Астрахань
Опубликовано 07.10.2022 в 16:30
Доехать
Астрахань
Даты: —
На чем: такси
Цель: Путешествия
Оплата: оплачу поездку
Никитина 39 лет, Буй
Опубликовано 07.10.2022 в 14:53
Ищу машину для поездки
Ярославль
Даты: —
На чем: попутка машина
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Rafael 24 года, Казань
Опубликовано 07.10.2022 в 14:43
Еду открывать сезон на сноуборде
Шерегеш
Даты: —
На чем: на лыжах
Цель: Знакомства Путешествия Спорт
Оплата: договоримся
Татьяна Архангельск
Опубликовано 07.10.2022 в 13:49
Путешествие
Архангельск
Татарстан
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Путешествия
Оплата: другое Самостоятельная оплата
Андрей 39 лет, Санкт-Петербург
Опубликовано 07.
10.2022 в 12:50
Компенсация расходов на поездку
Санкт-Петербург
Минск
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу
Оплата: беру деньги за поездку
Марина 38 лет, Москва
Опубликовано 07.10.2022 в 12:16
Совместное путешествие в жаркие страны на 7-10 дней с 17 …
Москва
Куба Доминиканская Республика Мальдивы Объединенные Арабские Эмираты Египет
Даты: —
На чем: турпутевка
Цель: Знакомства Путешествия Отдых
Оплата: договоримся пополам
Александр 55 лет, Астрахань
Опубликовано 07.10.2022 в 11:18
Не скучать
Астрахань Волгоград
Волгоград Астрахань
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу
Оплата: договоримся
Hulda Hanson 27 лет, Пермь
Опубликовано 07.10.2022 в 10:50
Для поездки в Казань
Даты: —
На чем: попутка
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: договоримся
татьяна 47 лет, Екатеринбург
Опубликовано 07.10.2022 в 09:43
доехать до работы
Патруши
Екатеринбург
Даты: —
На чем: машина
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Катюша 38 лет, Новосибирск
Опубликовано 07.
10.2022 в 09:30
Веселое времяпровождение
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: договоримся
Анна 21 год, Калининград
Опубликовано 07.10.2022 в 09:16
, но не с кем.
Абхазия Ямайка
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Нужна машина-попутка Знакомства Путешествия
Оплата: договоримся нуждаюсь в спонсоре пополам
Сергей 52 года, Свеча
Опубликовано 07.10.2022 в 09:05
Для заправки авто по цене билета на автобус
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу
Оплата: беру деньги за поездку
Устинья 24 года, Москва
Опубликовано 06.10.2022 в 23:34
Ищу попутчиков для совместных путешествий (длительных или…
Даты: —
На чем: своим ходом самолет автобус
Цель: Путешествия Отдых
Оплата: пополам
Евгений 56 лет, Краснодар
Опубликовано 06.10.2022 в 21:19
Ищу попутчицу , а может быть и компанию из нескольких чел…
Краснодар
Объединенные Арабские Эмираты Таиланд Египет
Даты: —
На чем: турпутевка
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
ГАЛИНА 57 лет, Москва
Опубликовано 06.
10.2022 в 21:11
для удешевления тура и компании
Москва
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Владимир 52 года, Брянск
Опубликовано 06.10.2022 в 21:06
Ищу «напарницу» для путешествий по России на фуре. В маши…
Брянск
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу Знакомства Путешествия Отдых Спорт Прогулки Культура
Оплата: хочу быть спонсором оплачу поездку
Юлия 40 лет, Абакан
Опубликовано 06.10.2022 в 20:42
Для совместного активного времяпрепровождения в новогодни…
Россия
Даты: —
На чем: турпутевка самолет
Цель: Знакомства Путешествия Отдых Прогулки Вечеринки Культура Поход
Оплата: пополам
Денис 35 лет, Пушкино
Опубликовано 06.10.2022 в 18:47
Знакомства, беседа, общие интересы, дружба
Пушкино
Москва
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу Знакомства Путешествия Отдых Спорт
Оплата: договоримся
Михаил 51 год, Санкт-Петербург
Опубликовано 06.10.2022 в 18:35
Катание на горных лыжах, совместное времяпровождение
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Знакомства Путешествия Отдых Спорт
Оплата: договоримся
ветров вася 0 лет, Москва
Опубликовано 06.
10.2022 в 16:34
дохать
Симферополь
Даты: —
На чем: машина
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: договоримся
Taras 36 лет, Kfar Monash
Опубликовано 06.10.2022 в 15:03
date
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Знакомства
Оплата: хочу быть спонсором
Марина 36 лет, Москва
Опубликовано 06.10.2022 в 14:48
Нужно передать 3 кг посылку в Казань 07 октября, днем
Москва
Казань
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Перевозки Другое
Оплата: договоримся
Денис 28 лет, Краснодар
Опубликовано 06.
10.2022 в 14:45
Доехать до Ейска
Краснодар
Ейск
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Дарья 22 года, Москва
Опубликовано 06.10.2022 в 12:18
Довезти вещи на фабрику
Москва
Псков
Даты: —
На чем: все равно попутка
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Вадим 53 года, Москва
Опубликовано 06.10.2022 в 11:47
Путешествие на своём авто. Ищем двоих попутчиков, чтобы р…
Москва
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу Знакомства Путешествия Отдых
Оплата: пополам
Дмитрий 43 года, Ростов-на-Дону
Опубликовано 06.10.2022 в 11:25
Для компании, общения
Ростов-на-Дону
Даты: —
На чем: все равно машина
Цель: Знакомства Путешествия
Оплата: пополам
Оксана 45 лет, Малые Дербеты
Опубликовано 06.10.2022 в 11:24
Доехать
Москва
Даты: —
На чем: машина
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Евгений 43 года, Баку
Опубликовано 06.
10.2022 в 11:23
Совместный отдых
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: договоримся
Alexander 46 лет, Ярославль
Опубликовано 06.10.2022 в 11:06
Дорога на работу и обратно
Ярославль
Ярославль
Даты: —
На чем: машина
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Елена 47 лет, Анапа
Опубликовано 06.10.2022 в 10:31
Для компании
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Путешествия
Оплата: договоримся
Андрей 50 лет, Москва
Опубликовано 06.
10.2022 в 09:34
Чтобы не было скучно.
Даты: —
На чем: машина самолет
Цель: Знакомства Путешествия Отдых Прогулки
Оплата: договоримся
Илья 54 года, Электросталь
Опубликовано 06.10.2022 в 09:22
Для удещевления и общения и отдыха в месте.
Москва
Дмитров
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Знакомства Путешествия Отдых
Оплата: пополам
Сергей 41 год, Москва
Опубликовано 06.10.2022 в 09:15
Попутчик
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Ольга 34 года, Екатеринбург
Опубликовано 06.
10.2022 в 09:07
поездка на Эльбрус + совместные походы по экскурсии
Эльбрус
Даты: —
На чем: все равно машина турпутевка самолет
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Таня 36 лет, Москва
Опубликовано 06.10.2022 в 08:50
Ищу попутчиков для совместного отдыха летим в Таиланд с 1…
Москва
Таиланд
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Путешествия Отдых Спорт Прогулки Вечеринки Культура
Оплата: пополам
Натали 41 год, Москва
Опубликовано 06.10.2022 в 08:23
Незабываемый отдых у моря
Даты: —
На чем: турпутевка самолет
Цель: Знакомства Путешествия Отдых
Оплата: договоримся
Игорь 32 года, Иркутск
Опубликовано 06.10.2022 в 06:20
Для совместного отдыха и аренды жилья в Бангкоке
Россия
Таиланд
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Отдых
Оплата: договоримся
Роман 38 лет, Крым
Опубликовано 06.10.2022 в 04:34
Для души
Даты: —
На чем: иное передвижение
Цель: Другое
Оплата: другое
Стас 44 года, Москва
Опубликовано 06.
10.2022 в 00:03
Компания
Москва
Туапсе
Даты: —
На чем: машина другой транспорт
Цель: Нужна машина-попутка Знакомства Путешествия
Оплата: договоримся оплачу поездку
Наталья 36 лет, Крым
Опубликовано 05.10.2022 в 23:10
Для совместной аренды жилья, с целью экономии бюджета и и…
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Ирина 60 лет, Краснодар
Опубликовано 05.10.2022 в 22:01
Доехать до Севастополя
Краснодар
Севастополь
Даты: —
На чем: машина автобус
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: договоримся
Алексей 40 лет, Москва
Опубликовано 05.10.2022 в 21:48
Вместе веселее
Турция
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Дмитрий 45 лет, Санкт-Петербург
Опубликовано 05.10.2022 в 20:51
Для путешествия
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу Путешествия
Оплата: беру деньги за поездку
Мария 37 лет, Серов
Опубликовано 05.10.2022 в 20:40
Совместное время препровождения
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Знакомства Путешествия Отдых Спорт Прогулки Культура Поход
Оплата: пополам другое
Дмитрий 66 лет, Москва
Опубликовано 05.10.2022 в 20:34
Доехать
Даты: —
На чем: все равно попутка
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: договоримся
Денис 30 лет, Москва
Опубликовано 05.10.2022 в 19:41
Еду домой
Москва
Астрахань
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу Перевозки
Оплата: беру деньги за поездку
Наталья 48 лет, Санкт-Петербург
Опубликовано 05.
10.2022 в 18:57
Поездки с метро Московская до ЖК «Зеленый квартал» в райо…
Санкт-Петербург
Даты: —
На чем: попутка
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Екатерина 34 года, Москва
Опубликовано 05.10.2022 в 17:58
Всем привет. Понимаю что сейчас трудно что загадывать, но…
Таиланд
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия Отдых Вечеринки
Оплата: другое сам за себя!
Наталья 43 года, Санкт-Петербург
Опубликовано 05.10.2022 в 17:56
Дополнительный заработок
Санкт-Петербург
Санкт-Петербург
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу
Оплата: беру деньги за поездку
Оля 36 лет, Москва
Опубликовано 05.10.2022 в 17:41
разделить свои расходы на поездку с попутчиками. не за…
Даты: —
На чем: турпутевка самолет автобус
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Вячеслав 44 года, Екатеринбург
Опубликовано 05.10.2022 в 17:24
совместное времяпрепровождение
Екатеринбург
Астана
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Знакомства Путешествия Отдых Прогулки
Оплата: договоримся
Максим 38 лет, Новосибирск
Опубликовано 05.
10.2022 в 17:20
Для компании
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Знакомства Путешествия Отдых Прогулки
Оплата: договоримся
Николай Анатольевич 52 года, Миасс
Опубликовано 05.10.2022 в 15:35
быстро и с комфортом добираться до нужного места
Даты: —
На чем: попутка машина
Цель: Нужна машина-попутка Я довезу
Оплата: договоримся оплачу поездку
Сергей 44 года, Геленджик
Опубликовано 05.10.2022 в 13:53
Возвращаюсь домой
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу
Оплата: беру деньги за поездку
Надежда 31 год, Москва
Опубликовано 05.10.2022 в 13:29
попутчик-девушка для удешевления тура.
Россия
Турция
Даты: —
На чем: турпутевка
Цель: Отдых
Оплата: пополам
Геннадий 45 лет, Рязань
Опубликовано 05.10.2022 в 12:34
Отдых
Вьетнам
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: договоримся
Юлия 36 лет, Казань
Опубликовано 05.10.2022 в 11:12
Ищу попутку для поездки с детьми к молодому человеку
Даты: —
На чем: попутка
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Елизавета 36 лет, Ярославль
Опубликовано 05.10.2022 в 08:58
Совместное путешествие
Москва
Даты: —
На чем: турпутевка самолет
Цель: Путешествия
Оплата: договоримся
Максим 38 лет, Новосибирск
Опубликовано 05.10.2022 в 08:10
Для компании совместного путешествия!
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Знакомства Путешествия Отдых Прогулки
Оплата: договоримся
Ира 46 лет, Екатеринбург
Опубликовано 05.
10.2022 в 07:04
Для компании. Одной скучно
Египет
Даты: —
На чем: турпутевка
Цель: Путешествия Отдых
Оплата: пополам
Владимир 41 год, Армавир
Опубликовано 05.10.2022 в 06:12
Не так будет скучно ехать
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу
Оплата: договоримся
Марина 54 года, Геленджик
Опубликовано 05.10.2022 в 05:59
Для компании
Даты: —
На чем: все равно машина самолет автобус самокат
Цель: Знакомства Путешествия Отдых Прогулки Вечеринки Культура
Оплата: нуждаюсь в спонсоре
Константин 42 года, Забайкальск
Опубликовано 05.
10.2022 в 04:02
Оплата бензина
Забайкальск
Чита
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу
Оплата: беру деньги за поездку
Елена 54 года, Томск
Опубликовано 05.10.2022 в 02:12
Для проведения незабываемого отдыха.
Даты: —
На чем: все равно самолет
Цель: Знакомства Путешествия Другое
Оплата: договоримся пополам
Mikhail 47 лет, Москва
Опубликовано 05.10.2022 в 02:01
Ищу компанию веселой девушки без комплексов
Москва
Даты: —
На чем: машина
Цель: Знакомства Путешествия Отдых
Оплата: договоримся
Сергей 38 лет, Москва
Опубликовано 05.10.2022 в 01:04
Общение
Турция
Даты: —
На чем: турпутевка
Цель: Знакомства
Оплата: приглашу в гости
Саша 20 лет, Барановичи
Опубликовано 04.10.2022 в 23:17
Чтоб доехать
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: договоримся
Влад 37 лет, Grigani
Опубликовано 04.10.2022 в 23:14
Совместная компания на отдыхе
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Знакомства Путешествия Отдых
Оплата: пополам
Михаил 44 года, Москва
Опубликовано 04.10.2022 в 23:05
Ищу девушку для приятного путешествия
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Знакомства Путешествия Прогулки
Оплата: оплачу поездку приглашу в гости
Константин 56 лет, Королев
Опубликовано 04.10.2022 в 23:03
Для поездки на моем автомобиле в Анапу 16.10.22г.
Москва
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу
Оплата: пополам
Артём Челябинск
Опубликовано 04.
10.2022 в 22:41
Поездки в соседние города
Даты: —
На чем: машина
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Игорь 36 лет, Москва
Опубликовано 04.10.2022 в 22:27
Для весёлой компании, каждый платит сам за себя
Даты: —
На чем: попутка своим ходом автобус
Цель: Путешествия
Оплата: другое Каждый сам за себя
Карина 26 лет, Санкт-Петербург
Опубликовано 04.10.2022 в 22:18
наслаждаться мягкими порывами ветра под жарким солнцем, о…
Санкт-Петербург Москва
Бали Шри-Ланка Таиланд Филиппины
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: договоримся нуждаюсь в спонсоре хочу в гости
Ирина 29 лет, Калуга
Опубликовано 04.10.2022 в 21:54
Мне нужна попутчик разный город встретиться с друзьями др…
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Отдых
Оплата: оплачу поездку
Николай 210 лет, Vaticano
Опубликовано 04.10.2022 в 21:52
Уехать куда подальше, лучше в Грузию.
Владикавказ Минеральные Воды Назрань
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Нужна машина-попутка Путешествия
Оплата: договоримся
Виктория 23 года, Уржум
Опубликовано 04.
10.2022 в 21:17
Буду рада еайти попутчика по маршруту Уржум -Советск 7 ок…
Уржум Советск
Советск
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Нужна машина-попутка Знакомства
Оплата: оплачу поездку
Анна 26 лет, Краснодар
Опубликовано 04.10.2022 в 21:09
Хотелось бы компанию для путешествий
Москва Сочи Краснодар
Дубай Стамбул
Даты: —
На чем: все равно
Цель: Знакомства Путешествия
Оплата: договоримся
Ирина 43 года, Казань
Опубликовано 04.10.2022 в 20:31
Для компании
Египет
Даты: —
На чем: турпутевка
Цель: Отдых
Оплата: пополам
Павел 37 лет, Пугачев
Опубликовано 04.10.2022 в 19:46
Нужна машина
Москва
Даты: —
На чем: попутка машина автобус
Цель: Нужна машина-попутка Я довезу
Оплата: оплачу поездку
Владимир 41 год, Азов
Опубликовано 04.10.2022 в 19:35
Для общения,знакомств,развлечения.Хорошего времяпровождения
Даты: —
На чем: машина своим ходом турпутевка
Цель: Знакомства Путешествия Отдых Вечеринки
Оплата: пополам приглашу в гости
Елена 27 лет, Крым
Опубликовано 04.
10.2022 в 17:08
Симферополь. На работу
Симферополь
Даты: —
На чем: все равно попутка
Цель: Нужна машина-попутка Я довезу
Оплата: оплачу поездку
светлана 56 лет, Калининград
Опубликовано 04.10.2022 в 14:42
ищу попутчицу в страны.мексика доминикана.аоэ с 20 октябр…
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Анастасия 23 года, Москва
Опубликовано 04.10.2022 в 14:19
Компания для отдыха, девушка, цель поездки просто отдохну…
Даты: —
На чем: турпутевка
Цель: Путешествия Отдых
Оплата: пополам
Екатерина 32 года, Москва
Опубликовано 04.10.2022 в 13:38
Удешевления тура
Даты: —
На чем: турпутевка
Цель: Путешествия Отдых Спорт Вечеринки
Оплата: пополам
Кирилл 33 года, Москва
Опубликовано 04.10.2022 в 13:00
Привет! Ищу попутчика в путешествие по Индии
Россия
Индия
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Сайгид 34 года, Москва
Опубликовано 04.
10.2022 в 11:48
Для совместного отдыха
Турция
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Знакомства Путешествия
Оплата: договоримся
Наталья 60 лет, Санкт-Петербург
Опубликовано 04.10.2022 в 11:38
Ездить до работы и обратно
Санкт-Петербург
Санкт-Петербург
Даты: —
На чем: машина
Цель: Нужна машина-попутка
Оплата: оплачу поездку
Дмитрий 34 года, Сургут
Опубликовано 04.10.2022 в 11:11
Возьму попутчицу для компании
Даты: —
На чем: машина
Цель: Я довезу Знакомства
Оплата: другое
Ирина Стамбул
Опубликовано 04.10.2022 в 10:22
Ищу попутчицу для самостоятельной поездки в Марокко или Б…
Даты: —
На чем: самолет
Цель: Путешествия
Оплата: пополам
Структурная основа для регуляции сигнального белка Crk с помощью переключателя пролина
Nat Chem Biol. Авторская рукопись; доступно в PMC 2011 Jul 1.
Опубликовано в окончательной редакции как:
Nat Chem Biol. 2011 январь; 7(1): 51–57.
Опубликовано онлайн 2010 декабрь 5. DOI: 10.1038/nchembio.494
PMCID: PMC3039521
NIHMSID: NIHMS257930
PMID: 21131971
, 1 , 1920202020201999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999991991991991999991919191919199теля
, 1 , 20202020019 2 и 1, 3, 4, *Авторская информация об авторских правах и информации об информации о лицензии
- Дополнительные материалы
Proline Switches, контролируемые Cis -Trrans6.
как особенно эффективный регуляторный механизм в широком спектре биологических процессов. Здесь мы сообщаем о структурах цис и транс конформеров пролинового переключателя в сигнальном белке Crk. Изомеризация пролина переключает Crk между двумя конформациями: автоингибирующей, стабилизированной внутримолекулярной ассоциацией двух тандемных доменов Sh4 в цис-форма и неингибированная активированная конформация, обеспечиваемая транс-формой . В дополнение к действию в качестве структурного переключателя гетерогенный пролин рекрутирует циклофилин А, который ускоряет скорость взаимопревращения между изомерами, тем самым регулируя кинетику активации Crk. Данные дают атомарное представление о механизмах, лежащих в основе функциональности этого бинарного переключателя, и объясняют его поразительную эффективность. Результаты также выявили новые поверхности связывания Sh4, подчеркивающие универсальность связывания и расширяющие репертуар неканонических лигандов этого важного сигнального домена.
Семейство адапторных белков Crk повсеместно экспрессируется в большинстве тканей и опосредует своевременное образование белковых комплексов, вызванное различными внеклеточными стимулами, включая различные факторы роста и дифференцировки 1 , 2 . Белки Crk избыточно экспрессируются при многих видах рака человека 3 – 5 , и было обнаружено, что они стимулируют активность Abl 6 , киназы, слияние которой с Bcr вызывает хронический миелогенный лейкоз 7 . Клеточный Crk (c-Crk-II) состоит из одного домена Sh3, N-концевого домена Sh4 (Sh4 N ) и С-концевого домена Sh4 (Sh4 C ) (). Домены Sh4 N и Sh4 C связаны длинным линкером из 50 остатков, который содержит остаток Tyr (Tyr222 у курицы), который фосфорилируется с помощью Abl 8 . Crk выполняет свою функцию, используя свои домены Sh3 и Sh4 N , которые избирательно связываются с мотивами pY-x-x-P и P-x-L-P-x-K, соответственно, для взаимодействия с различными белками 9 , 10 .
Напротив, недавняя структурная работа на курице 11 и Crk 12 человека показала, что Sh4 C играет ауторегуляторную роль, что согласуется с более ранними биологическими результатами 13 – 16 .
Открыть в отдельном окне
Организация домена Crk
(а) Схема организации домена Crk. Pro238, который подвергается цис-транс 9Указаны изомеризация 0006 и остаток тирозина (Tyr222), который фосфорилируется с помощью Abl. (б) Схема изомеризации цис-транс по связи пролил Gly237-Pro238.
Недавно мы показали 11 , что связывающая активность куриного Crk модулируется цис-транс-изомеризацией в Pro238, высококонсервативном остатке пролина (дополнительная рис. 1) 17 , 9 10 В отличие от ковалентных модификаций, обеспечиваемых посттрансляционными процессами, изомеризация пролина представляет собой внутренний процесс конформационного обмена, который может контролировать активность белка 19 , 20 без изменения ковалентной структуры белка.
Изомеризация пролина может выполнять свою функцию через несколько, не исключающих друг друга механизмов, включая (i) значительные конформационные изменения, вызванные поворотом на 180° вокруг пролильной связи, (ii) медленную кинетику изомеризации, обеспечивающую молекулярный таймер, (iii) и рекрутирование пролил цис-транс ферментов изомеразы (PPIases) 21 . По этим причинам пролин цис-транс Изомеризация становится критическим компонентом постоянно растущего числа важных биологических процессов, включая передачу сигналов клеток 11 , 22 , 23 , Нейродегенерация 24 , Amyloidogegenesis 25 , Gannel Gate Gating . 26 , генная регуляция 27 , 28 , фаговая и вирусная инфекция 29 , 30 , функция фермента 9 0 31 020 32 и распознавание лиганда 33 .
Однако, несмотря на важность изомеризации цис-транс , существует удивительная нехватка структурных данных с высоким разрешением, объясняющих эффект, который этот процесс может вызывать в белке. Т.о., как изомеризация пролина приводит к функциональному бинарному переключателю, остается плохо изученным.
Здесь мы представляем структуры с высоким разрешением как цис-, так и транс- конформеров Pro238 в Crk. Данные показали, что линкер экстенсивно взаимодействует с Sh4 C , и взаимодействие сильно модулируется изомеризацией пролина. Замечательная конформационная перестройка, вызванная изомеризацией цис-транс , наделяет конформеры отчетливыми свойствами связывания: в форме цис два домена Sh4 взаимодействуют внутримолекулярным образом, создавая автоингибирующую конформацию, которая предотвращает связывание физиологических лигандов, таких как как киназа Abl; напротив, в форме транс два домена Sh4 не взаимодействуют, и Crk существует в неингибированной конформации, компетентной в отношении связывания лиганда.
Интересно, что все эти взаимодействия опосредованы новыми поверхностями связывания Sh4. Результаты (i) обеспечивают беспрецедентное понимание резкого, дальнодействующего конформационного эффекта, который может вызывать изомеризация пролина, представляющего собой элегантный механизм регуляции активности белка, и (ii) подчеркивают универсальные и уникальные свойства связывания модульного домена Sh4.
Структура
транс и цис конформеров Crk Ранее мы показали 11 , что Pro238 в Crk подвергается цис-транс изомеризации (), что приводит к двум различным, одинаково населенным конформационным состояниям связи -Sh4 C (l-Sh4 C ) полипептид (дополнительная рис. 2a). Из-за изначально высокой энергии активации вращения вокруг пролильной связи (~20 ккал моль -1 ) 17 два конформационных состояния взаимопревращаются друг с другом с очень низкой скоростью. Более того, конформеры цис и транс в Crk l-Sh4 C заселены одинаково (~ 50% каждый; дополнительная рис.
2а). Эти благоприятные условия позволили полностью охарактеризовать ЯМР и определить структуру обоих конформеров (и дополнительный рисунок 3 и дополнительные методы).
Открыть в отдельном окне
Структурная характеристика транс и цис Конформеры Crk l-Sh4 C
(a,b) Структура полипептида Crk l-Sh4 C в цис- конформация. На (а и с) домен Sh4 C окрашен в голубой цвет, а линкер окрашен в серый цвет. Pro238 показан красным. N и C обозначают N- и C-концы. На (b и d) домен Sh4 C показан в виде полупрозрачной поверхности и остатков, вовлеченных в линкер-Sh4 C взаимодействия выделены. Остатки линкера и Sh4 C окрашены в зеленый и желтый цвет соответственно. Пунктирные линии обозначают водородные связи.
Изомеризация Pro модулирует внутримолекулярные взаимодействия. В обоих конформерах домен Sh4
C принимает типичную складку Sh4; однако из-за отсутствия ароматических остатков в его каноническом сайте связывания Sh4 C не связывает последовательности типа полипролина II (PPII) 13 , 34 .
Наложение структур цис и транс конформеров показало, что изомеризация вокруг пролильной связи Gly237-Pro238 приводит к заметно отличающимся конформациям линкера по отношению к Sh4 C (). В форме транс петля Sh4 C n-src принимает типичную конформацию, наблюдаемую в большинстве доменов Sh4. Однако в цис образуют петлю n-src, которая значительно перестраивается, чтобы приспособиться к линкеру, который в результате конформации цис , принятой пролильной связью Gly237-Pro238, вынужден еще больше приблизиться к Sh4 C (). Интересно, что Sh4 C использует одну и ту же поверхность для взаимодействия с линкером как в цис , так и в транс конформерах, но различные наборы взаимодействий стабилизируют их.Открыть в отдельном окне
Структурное сравнение Trans и CIS Isomers
(A) СУПЕРПОЗИЦИЯ TRANS и CIS Конформеры L-SH4 C на домене SH4 C (остатки 239–295).
Домен Sh4 C в конформациях транс и цис окрашен в светло- и темно-серый цвет соответственно. Линкер принимает совершенно другую структуру в конформации -транс- (зеленый) и -цис- (фиолетовый). Указаны репрезентативные остатки в линкере. Конформация петли n-src отличается в транс (зеленый) и конформер цис (фиолетовый). (б) Влияние цис-транс-изомеризации на структуру Sh4 C . Показана конформация боковой цепи выбранных остатков. Боковая цепь Phe239 подвергается воздействию растворителя в цис-изомере (фиолетовый), тогда как она скрыта в транс-изомере (зеленый). Наложение структур и цветового кода такое же, как в (а). (в) Leu231 полностью погружен в гидрофобный карман в Sh4 C в конформации цис . Конформация боковой цепи остатков, выстилающих гидрофобный карман, показана в цис- (фиолетовый) и транс- (зеленый) изомерах.
(d,e) Доступная для растворителя поверхностная презентация конформаций транс- (d) и цис- (e). Модели повернуты примерно на 60° вокруг оси z относительно моделей на (а), при этом линкер обращен к читателю. Поверхность, представленная линкером, очерчена.
Взаимодействие линкера с Sh4 C в конформере транс опосредуется преимущественно гидрофобными контактами. Более конкретно, Ala223, Ile227, Pro230 и Pro232 в линкере взаимодействуют с Phe239, Lys269, Ile270, Asn271, Trp276 и Leu294 в Sh4 C (10). Взаимодействие линкер-Sh4 C дополнительно усиливается за счет водородных связей, образующихся между Asn233 и Lys269 и между Asn236 и Gln297. В целом, взаимодействие линкер-Sh4 C скрывает замечательное ~1150 Å 2 поверхности (дополнительный рис. 4а). Последние 10 С-концевых остатков линкера (от Ile227 до Asn236) тесно взаимодействуют с доменом Sh4 C . Напротив, остатки, предшествующие Ile227, отличные от Ala223, по-видимому, не образуют сильных и постоянных контактов с Sh4 C , наблюдение, которое дополнительно подтверждается анализом релаксации ЯМР, показывающим, что действительно N-концевые линкерные остатки очень гибки на быстрая (пико-наносекундная, пс-нс) временная шкала (см.
ниже).
В отличие от конформера транс , взаимодействие линкер-Sh4 C в конформере цис опосредуется исключительно гидрофобными контактами (). Фактически только три остатка линкера (Pro230, Leu231 и Leu234) взаимодействуют с Sh4 C (и дополнительная рис. 4b). Тем не менее, взаимодействие линкер–Sh4 C в конформере цис закрывает ~1,140 Å 2 поверхности, что равно количеству поверхности, заглубленной в транс конформер. Причина в том, что в конформере цис N-концевая часть линкера (остатки от Pro221 до Ile227) загибается и упаковывается относительно C-концевой части линкера (остатки от Pro230 до Asn236) (дополнительная рис. 5). В то время как в конформере транс Pro230 и Pro232 обращены друг к другу и взаимодействуют с Sh4 C (), в конформере цис эти два остатка Pro образуют гидрофобный карман, обращенный к линкеру с Pro225 и Ile227, плотно прилегающими к нему (дополнительный рис.
5). Интересно, что в 9В конформере 0005 цис боковая цепь Leu231 полностью погружена в гидрофобный карман в Sh4 C , выстланный остатками Ala241, Val267, Trp276, Phe289 и Val292 (). Сильный линкер-гидрофобные контакты Sh4 C приводят к значительной стабилизации интерфейса и, таким образом, цис-конформера , который в равной степени заселен конформеру транс-.
Пластичность поверхности Sh4
C Prolyl цис-транс изомеризация по Pro238 приводит к большой конформационной перестройке линкера в двух конформерах (). Как следствие, линкер представляет для связывания совершенно другую поверхность, чем Sh4 C . Примечательно, что поверхность Sh4 C , взаимодействующая с линкером, резко адаптируется между конформерами цис и транс , чтобы оптимизировать контакты связывания с альтернативными конформациями линкера (1). Петля Sh4 C n-src претерпевает наиболее значительные конформационные изменения между цис и транс конформеры с максимальной трансляцией ~8 Å ().
В результате многие из n-src и соседних боковых цепей перестраиваются, яркими примерами являются остатки Phe239, Trp276, Phe289 и Ile270. В конформере транс линкерные остатки Ile227, Pro230 и Pro232 опосредуют все гидрофобные контакты с Sh4 C . В конформере цис Ile227 и Pro232 выходят из интерфейса линкер-Sh4 C ( и ), чтобы вместе с Pro230 и Pro225 сформировать гидрофобное ядро внутри линкера (дополнительная рис. 5). Чтобы компенсировать потерю этих линкеров – Sh4 C гидрофобных контактов, а также при полном отсутствии полярных взаимодействий линкер в цис-конформере использует Leu231 для прочного взаимодействия с Sh4 C (). Ile270, Trp276 и Phe289 из Sh4 C регулируют конформацию своей боковой цепи с образованием глубокого гидрофобного кармана, в который входит боковая цепь Leu231 и полностью зарывается (и Дополнительный фильм ). Интересно, что конформация, принятая Phe239 в конформере транс , несовместима со связыванием Leu231 с глубоким карманом, и в результате транс — в цис изомеризация Phe239 вытесняется из внутренней части белка ( транс ) и полностью подвергается воздействию растворителя ( цис ) ().
Сильно отличающиеся конформации Sh4 C и линкера, индуцированные цис-транс изомеризацией , приводят к различным поверхностям l-Sh4 C , потенциально придавая двум конформерам разные связывающие и физико-химические свойства ().
Динамические изменения, вызванные
цис-транс-изомеризация Цис-транс-изомеризация вызывает резкое структурное изменение как в линкере, так и в домене Sh4 C . Вносит ли процесс изомеризации изменения в динамику белка? Чтобы ответить на этот вопрос, мы измерили скорости релаксации основной цепи 35 , 36 , чтобы получить специфичную для сайта информацию о параметрах порядка связи NH (дополнительная рис. 6). Параметр заказа, S 2 , является мерой амплитуды внутренних движений в пико-наносекундной (пс-нс) временной шкале и может варьироваться от S 2 =1 для вектора связи, не имеющего внутреннего движения, до S 2 = 0, для вектора связи, быстро отбирающего несколько ориентаций 36 .
Цис-транс изомеризация в Pro238 приводит к значительным изменениям в S 2 по всему Crk l-Sh4 C (). В районе Pro238 наблюдается значительное повышение гибкости при переходе от транс в изомер цис предположительно в результате увеличения воздействия растворителя на Phe239 (). Аналогичная тенденция наблюдалась и в районе Иле270 по той же причине. Напротив, изомеризация транс-цис вызывает значительную ригидность линкера, особенно вблизи Leu231, остатка, который полностью скрыт в гидрофобном кармане в домене Sh4 C в цис-изомере (). Более того, в большей части петли n-src имеется значительная жесткость в результате более плотной упаковки между этой петлей и линкером. Кроме того, большинство линкерных остатков, по-видимому, немного более жесткие в цис--конформер, чем -транс-, в первую очередь из-за улучшенной упаковки внутри линкера в -цис-конформере (дополнительная рис.
5). Таким образом, данные свидетельствуют о том, что цис-транс-изомеризация вызывает не только значительные структурные изменения (,), но и значительные изменения в движении белка ().
Открыть в отдельном окне
Динамическая характеристика транс и цис изомеров
(a) Параметры порядка связи N-H, S 2 , построенные в зависимости от первичной последовательности, для конформеров транс (синий) и цис (красный) l-Sh4 C . (b) Изменения в параметрах порядка, ΔS 2 , между конформерами транс и цис , нанесенными на карту с использованием цветового кода градиента на структуре цис l-Sh4 C . ΔS 2 задается как S 2 ( транс ) – S 2 ( цис ), поэтому положительные значения ΔS 2 обозначают повышенную жесткость белкового остова в конформации транс по сравнению с цис конформацией.
Структурная основа взаимодействия Sh4
N –Sh4 C ) существует в растворе в двух конформациях: основной (90%), где Gly237–Pro238 принимает конформацию цис , а два домена Sh4 (Sh4 N и Sh4 C ) взаимодействуют внутримолекулярным образом (закрытая конформация) и минорным (10%), где Gly237–Pro238 принимает конформацию транс-, и два домена Sh4 не взаимодействуют (открытая конформация) (дополнительная рис. 7). ЯМР-анализ показывает, что Crk курицы полной длины принимает аналогичную закрытую конформацию. Теперь мы предоставим атомарное представление об этом очень интересном процессе связывания, определив структуру закрытой конформации Crk 9.0019 SLS (и дополнительный рис. 3c).Открыть в отдельном окне
Структурная характеристика Crk SLS в закрытой, автоингибируемой конформации
(а) Низкоэнергетическая структура Crk N SLS в мультяшном цвете 90 с Sh0 розовым цветом , Sh4 C светло-голубого цвета и линкер серого цвета.
(б) Крупный план интерфейса Ш4 Н – Ш4 С . Ш4 Н и Ш4 9Остатки 0019 C окрашены в зеленый и оранжевый цвета соответственно. (c) Вид сверху Sh4 C , который показан в виде прозрачного синего шаржа. Sh4 N отображается розовой поверхностью, доступной для растворителя. Остатки Sh4 C , взаимодействующие с Sh4 N , показаны в виде оранжевых палочек. (d) Структура Sh4 N в комплексе с консенсусным пептидом PPII (P-x-P-L-x-K) 10 . Ориентация Sh4 N на (в) и (г) одинакова. Сравнение (c) и (d) показывает, что сайт связывания PPII в Crk SLS недоступен.
Структурные данные показали, в соответствии с данными анализа химического сдвига, что два домена Sh4 активно взаимодействуют в замкнутом Crk SLS (). Домен Sh4 N использует свой канонический сайт связывания, обычно взаимодействующий с лигандами PPII, для взаимодействия с Sh4 C .
В частности, кластер ароматических остатков Sh4 N (Phe142, Phe144, Trp170 и Tyr187) вместе с Pro184 и Pro186 образует удлиненную гидрофобную открытую для растворителя поверхность, содержащую его канонический сайт связывания лиганда (). Этот сайт хорошо подходит для взаимодействия с гидрофобными последовательностями, такими как последовательности, богатые пролином. Ин Крк, Sh4 C использует гидрофобные остатки Pro238, Phe239 и Ile270 для взаимодействия с каноническим сайтом связывания Sh4 N (). Взаимодействие дополнительно усиливается за счет образования двух полярных контактов: водородной связи между Gln169 и Lys266 и солевого мостика между Asp143 и Lys269. В целом взаимодействие Sh4 N – Sh4 C покрывает общую поверхность ~800 Å 2 .
Домен Crk Sh4 N селективно связывается с лигандами PPII, несущими мотив последовательности P-x-L-P-x-K 37 (), например киназа Abl 38 .
Остатки Pro1, Leu3 и Pro4 лиганда PPII плотно упакованы против гидрофобных остатков в Sh4 N , тогда как Lys6 образует солевые мостики с консервативными кислотными остатками 10 (). Sh4 C использует аналогичный набор взаимодействий для специфического связывания с Sh4 N : Pro238 и Phe239 Sh4 C занимают сходные положения относительно Sh4 N по отношению к Pro4 и Leu3, соответственно, пептида PPII. Глн297, который образует водородную связь с Sh4 N , находится в положении, сходном с Lys6 пептида PPII, тогда как Lys269 образует солевой мостик с Asp143 (), высококонсервативным остатком, который не участвует, хотя и в взаимодействие между Sh4 N и пептидом PPII (). Интересно, что сопоставление Sh4 N с лигандом PPII оказывается более оптимальным, чем с Sh4 C , поскольку комплексообразование закапывает ~1120 Å 2 в первом случае, но только ~800 Å 2 в последнем.
Довольно небольшой интерфейс между Sh4 N и Sh4 C согласуется с низкой свободной энергией (ΔG) взаимодействия Sh4 N – Sh4 C , которая составляет всего ~ 1,4 ккал моль -1 (дополнительный рис. 7б).
Взаимодействие Sh4
N – Sh4 C опосредуется конформером цис Анализ закрытой структуры Crk SLS показал, что Pro238 уникальным образом принимает цис 9Конформация 0006. Интересно, что Pro238 принимает конформацию транс в минорной открытой конформации Crk SLS . Таким образом, в соответствии с нашим предыдущим анализом химического сдвига (дополнительная рис. 7a) 11 структурные данные показали, что внутримолекулярное взаимодействие между двумя доменами Sh4 опосредуется исключительно конформером цис . Настоящие данные обеспечивают теперь структурную основу для этого наблюдения. отображает наложение структур Crk SLS и цис и транс конформеры l-Sh4 C , наложенные на домен Sh4 C .
Взаимодействие Sh4 N – Sh4 C в основном опосредуется остатками Sh4 C Pro238, Phe239 и Ile270. Структурные данные ясно показывают, что все эти три остатка хорошо подходят для взаимодействия с доменом Sh4 N в конформере цис . Напротив, в конформере транс Phe239расположен внутри домена Sh4 C , а Ile270 отклоняется к центру домена Sh4 C в результате радикальной перестройки, которой подвергается n-src петля, вызванная изомеризацией цис-транс (и). Таким образом, ни Phe239, ни Ile270 не готовы взаимодействовать с доменом Sh4 N в конформации транс (дополнительный фильм ).
Открыть в отдельном окне
Структурная основа для конформера Sh4 N –Sh4 C interaction in Crk SLS
(a) Superposition of the cis and trans l-Sh4 C and Crk SLS on the Sh4 C domain.
Боковые цепи Pro238, Phe239 и Ile270, остатки, в основном опосредующие взаимодействие Sh4 N – Sh4 C , показаны зеленым цветом для транс , желтым для цис l-Sh4 C и оранжевым для Crk. SLS . Ш4 N показан как доступная для растворителя поверхность. (b) Влияние замены одной аминокислоты на стабильность закрытой конформации Crk SLS , оцененное путем измерения популяции закрытых и открытых конформаций Crk SLS с помощью ЯМР. ΔG для P238A и L231G является нижним пределом, поскольку популяции менее ~ 5% выходят за пределы обнаружения ЯМР.
Phe239 претерпевает наиболее значительные конформационные изменения при изомеризации цис-транс ( и ) и, по-видимому, играет ключевую роль в опосредовании Sh4 9Обвязка 0019 Н –Ш4 С . Действительно, замена Phe239 на Ala отменяет внутримолекулярное взаимодействие, а Crk SLS -F239A принимает преимущественно открытую конформацию (и дополнительный рисунок 8).
Точно так же замена P238A также отменяет закрытую конформацию (). Чтобы проверить влияние дестабилизации конформации цис на целостность закрытой конформации, мы подготовили и охарактеризовали замены Pro232 и Leu231, двух остатков, которые важны для стабилизации цис-конформер за счет гидрофобных взаимодействий (дополнительная рис. 5). Действительно, замена P232A снижает стабильность закрытой конформации Crk SLS примерно на 1,1 ккал моль -1 , тогда как замена L231G, по-видимому, полностью отменяет закрытую конформацию (и дополнительный рисунок 8). Интересно, что Pro238 совместим со связыванием Sh4 N как в конформациях цис , так и транс (). Таким образом, изомеризация пролила регулирует специфичность связывания не напрямую посредством фактической конформации самого пролина, а косвенно, путем «лепки» Sh4 9.0019 C Поверхность, отвечающая за привязку к Ш4 N .
Взаимодействие Sh4
N – Sh4 C приводит к аутоингибированию Crk изолированный домен Sh4 N 11 .
Настоящие данные обеспечивают структурную основу для ингибирования. Sh4 C связывается с Sh4 N и маскирует канонический сайт связывания PPII, тем самым обеспечивая механизм саморегуляции. Действительно, киназа Abl, которая взаимодействует с Crk Sh4 N посредством мотива последовательности P-x-L-P-x-K, связывается с закрытой, аутоингибируемой формой Crk SLS с аффинностью в 10 раз ниже, чем с открытой формой Crk SLS , индуцированной заменой F239A (дополнительная рис. 9). Таким образом, связывание лиганда с Crk ингибируется в -цис--форме, но усиливается в 9-й цис-форме.0005 транс форма.Новые поверхности связывания Sh4
Взаимодействия линкер–Sh4 C и Sh4 N –Sh4 C опосредуются новым набором поверхностей и контактов Sh4, ранее не встречавшихся в доменах Sh4. В частности, линкер интенсивно взаимодействует с поверхностью домена Sh4 C , очерченной β-цепями a и e и петлей n-src (дополнительная рис.
10). Примечательно, что линкер взаимодействует с этой поверхностью Sh4 C как в цис и транс конформеры, хотя отдельный набор контактов стабилизирует эти две конформации. Взаимодействие довольно обширное, поскольку оно покрывает ~ 1150 Å 2 поверхности. Более того, Sh4 C использует новую связывающую поверхность для взаимодействия с другим доменом Sh4 в Crk, Sh4 N (дополнительная рис. 10). Эти две поверхности различны и не исключают друг друга, поскольку в закрытой форме Crk SLS Sh4 C связан как с линкером, так и с Sh4 9.0019 N одновременно. Таким образом, настоящие данные дополнительно подчеркивают универсальность связывания доменов Sh4 и расширяют список неканонических лигандов, которые могут взаимодействовать с этим небольшим сигнальным доменом.
Изомеризация пролина цис-транс представляет собой новый регуляторный механизм, участвующий в регуляции активности широкого спектра биомолекулярных процессов.
Понимание механизмов, лежащих в основе таких молекулярных переключателей, требует наличия структурных данных как о цис и транс конформеры. Ограниченная структурная информация 19 , 20 , 39 по обоим конформерам, доступная до сих пор, позволяет предположить довольно локальный эффект, вызванный изомеризацией пролина. Здесь мы приводим атомные подробности структурных и динамических изменений, вызванных цис-транс-изомеризацией пролина в сигнальном белке Crk. Данные демонстрируют, что изомеризация пролина вызывает значительную реорганизацию интерфейса между линкером и Sh4 9.0019 C до такой степени, что два получившихся конформера представляют совершенно разные поверхности (). Примечательно, что два конформера наделены различными связывающими свойствами: цис один способствует внутримолекулярному взаимодействию двух доменов Sh4 для сборки авторегуляторной конформации, а транс конформер способствует гантелеобразной, неингибируемой конформации (, дополнительный фильм).
).
Каким образом поворот на 180° вокруг одной пролильной связи может оказывать такое сильное влияние на глобальную структуру белка? Pro238 в Crk расположен в стратегической позиции, где линкер соединяется с Sh4 9.0019 С домен. В конформере транс линкер экстенсивно взаимодействует с доменом Sh4 C . Транс-цис-изомеризация в Pro238 вызывает новую конформацию линкера, тем самым нарушая все контакты между линкером и Sh4 C , присутствующим в форме транс . Примечательно, что и линкер, и домен Sh4 C перестраивают свою структуру, и формируется новый набор контактов для стабилизации конформера цис . В результате Sh4 9Домен 0019 C обнажает несколько остатков, которые образуют связывающую поверхность, способную опосредовать специфическое взаимодействие между Sh4 C и Sh4 N (и , дополнительный фильм ). В форме -транс- этот набор остатков скрыт, и поэтому взаимодействие Sh4 N — Sh4 C невозможно, что приводит к гантелеобразной конформации.
Таким образом, структурной основой для функции Pro238 в качестве молекулярного переключателя является «лепка» поверхности, обеспечиваемая фактическим процессом изомеризации.
Переключатель пролина в Crk играет очень важную физиологическую роль, поскольку он переключает белок между закрытой и открытой конформацией (). Фактически, открытая конформация, которая малонаселенна (~10%), представляет собой активированную форму Crk, в которой сайт связывания PPII доступен для физиологических лигандов. Действительно, Abl предпочтительно связывается с открытой формой Crk (дополнительная рис. 9) 11 . Энергетика равновесия между аутоингибируемой и активированной формой регулируется пролиновым переключателем, поскольку только 9Изомер 0005 цис стабилизирует закрытую форму. Однако изомеризация пролина по своей сути является очень медленным процессом (порядка минут), что делает кинетику молекулярного переключения особенно медленной (2). Интересно, что циклофилин А (CypA) резко ускоряет скорость взаимопревращения 11 до миллисекундного режима при физиологических температурах, что является более значимой шкалой времени для модуляции кинетики биологических процессов.
Таким образом, изомеризация пролина в Crk функционирует как молекулярный таймер, с помощью которого можно регулировать энергетику и скорость образования сигнальных комплексов.
Открыть в отдельном окне
Механизмы регуляции активности Crk
Crk принимает преимущественно (~90%) закрытую, аутоингибируемую конформацию, но небольшая популяция (~10%) принимает открытую, неингибированная конформация, в которой сайт связывания PPII на Sh4 N доступен для связывания. Мотив P-x-L-P-x-K Abl связывается с Sh4 N с относительно сильным сродством (K d ~ 1 мкМ). Открытая конформация существует как равновесие между цис и транс изомер, но только цис образует закрытую конформацию. Скорости интерконверсии цис-транс регулируются действием CypA, который ускоряет интерконверсию на четыре порядка 11 .
В какой степени этот регуляторный механизм используется другими членами семейства Crk, еще предстоит выяснить.
Pro238 строго консервативен среди всех белков Crk (дополнительная рис. 1), что повышает вероятность того, что изомеризация пролина может быть консервативным признаком. Интересно, что наши данные также указывают на то, что идентичность остатка, следующего за пролином, определяет популяцию цис форма. Например, замена F239A уменьшает популяцию цис до ~8% по сравнению с 50% в белке дикого типа. Это положение варьируется среди белков Crk (дополнительная рис. 1). Таким образом, возможно, что изомеризация пролина присутствует и в других белках Crk, хотя относительная популяция двух конформеров может быть не такой высокой, как в курином Crk. Интересно, что фосфорилирование тирозина (Tyr222) 40 и наличие сайта связывания Abl Sh4 в домене Crk Sh3 41 обеспечивают дополнительные механизмы регуляции активности Crk. Интересно, что в адапторном белке присутствуют множественные уровни регуляции, и будет важно определить относительный вклад каждого из этих механизмов в модулирование ответа Crk на разные стимулы.
Настоящие результаты, в соответствии с предыдущими наблюдениями 11 , 12 , подчеркивают важность домена Sh4 C в установлении и стабилизации автоингибирующей конформации в Crk. Точечные мутации или делеции в Sh4 9Домен 0019 C стимулирует трансформирующую активность Crk 6 , 13 , 16 и повышает уровень его экспрессии в злокачественных опухолях головного мозга и легких 3 . Например, v-Crk, вирусная онкогенная форма Crk, которая первоначально была выделена как вирус саркомы птиц в куриных опухолях 42 , и c-Crk-I, альтернативная клеточная форма сплайсинга, не имеют домена Sh4 C и линкер, и они связаны с повышенной трансформирующей активностью 12 , которым нельзя управлять. Даже единичные точечные мутации в домене Sh4 C (например, W276K), которые, как известно, нарушают укладку домена, достаточны для значительного увеличения активности Crk 43 .
Интересно, что структурные исследования Crk 12 человека и Crk цыпленка (эта работа) показывают, что в обоих случаях домен Sh4 N автоингибируется, но за блокировку сайта связывания PPII-лиганда ответственны разные структурные элементы (дополнительная рис. 11). .
Особенно поразительный результат в настоящей работе связан с универсальностью домена Sh4 в качестве партнера по связыванию 44 , 45 . Взаимодействие между Sh4 N и Sh4 C в Crk дает первый пример комплекса Sh4-Sh4, опосредованного прямыми контактами между двумя доменами. Более того, поверхности, используемые Sh4 C для взаимодействия с линкером и Sh4 N , представляют собой новые поверхности связывания для доменов Sh4. Примечательно, что почти вся поверхность (дополнительная рис. 10) такого небольшого домена может быть сформирована для размещения широкого спектра лигандов без явного сходства последовательности или структуры.
Белковый препарат
Использовали следующие конструкции Crk (курица): полноразмерный Crk (остатки 1–305), Crk SLS (остатки 139–305) и l-Sh4 C (остатки 218–305). ). Различные конструкции Crk амплифицировали с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду, кодирующую полноразмерный белок Crk, встраивали в вектор pGEX6P-1, сконструированный с сайтом расщепления протеазой PreScission, и трансформировали в клетки BL21(DE3). Образцы ЯМР готовили, как описано в дополнительной информации.
ЯМР-спектроскопия
ЯМР-эксперименты проводились на спектрометрах Varian 800 и 600 МГц и Bruker 700 и 600 МГц. Полное назначение основной и боковой цепи для изученных белков Crk было достигнуто с использованием стандартных импульсных последовательностей с тройным резонансом. NOE измеряли с помощью экспериментов 2D и 3D NOESY ( 13 C и 15 N, отредактированных) с использованием времени перемешивания 80 и 100 мс. Все образцы ЯМР готовили в 50 мМ KPi (рН 5,5), 140 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ и 1 г л −1 NaN 3 .
Изомеризация Pro238, а также относительная популяция изомеров не чувствительны к pH в диапазоне 5,5–7,5 (дополнительная рис. 12). Концентрация белков составляла 0,6–0,8 мМ. Спектры записывали при 22°С. Данные RDC 46 были собраны и проанализированы 47 , как подробно описано в дополнительной информации.
Расчет и уточнение структуры
Расчеты структуры выполнены с помощью Xplor-NIH 48 . 13 Cα, 13 Cβ, 13 C’, Hα, 15 Химические сдвиги N и NH служили входными данными для программы TALOS 49 для извлечения двугранных (φ и ψ) углов. Ограничения по расстоянию, полученные из спектров NOESY, были разделены на 3 категории с верхними границами расстояний 2,8, 3,5 и 5,0 Å. Ограничения RDC были включены на заключительных этапах расчета. Статистика Рамачандрана для цис l-Sh4 C , транс l-Sh4 C и Crk SLS , соответственно, следующие: остатки в наиболее предпочтительных областях: 71, 66 и 65; остатки в дополнительно разрешенных областях: 26, 32 и 29; остатки в широко разрешенных областях: 3, 2 и 6; остатки в запрещенных областях: 0, 0 и 0.
Сводная информация об ограничениях ЯМР и статистика уточнения структуры представлена в дополнительной таблице 1. Н- 15 N NOE, скорость продольной релаксации R 1 и скорость поперечной релаксации R 2 50 . Подробности приведены в дополнительной информации.
Эксперименты с ITC
Калориметрическое титрование проводили на микрокалориметре iTC200 (Microcal), как подробно описано в дополнительной информации.
Коды доступа
Банк данных белков: Координаты для цис- и транс- конформеров l-Sh4 C и Crk SLS были депонированы с кодами доступа 2L3P, 2L3Q и 2L3S соответственно.
1
Нажмите здесь для просмотра. (6.7M, pdf)
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения США (GM80308 для C.G.K.).
Конкурирующие финансовые интересы Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
1. Бирге Р.Б., Калодимос С., Инагаки Ф., Танака С. Адаптерные белки Crk и CrkL: сети для физиологической и патологической передачи сигналов. Сигнал сотовой связи. 2009 г.;7:13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
2. Феллер С.М. Формирование сигнальных комплексов семейства Crk и биологическая роль. Онкоген. 2001; 20: 6348–71. [PubMed] [Google Scholar]
3. Miller CT, et al. Повышенная экспрессия протоонкогена C-CRK связана с агрессивным фенотипом аденокарцином легких. Онкоген. 2003; 22:7950–7. [PubMed] [Google Scholar]
4. Nishihara H, et al. Молекулярный и иммуногистохимический анализ сигнального адапторного белка Crk при раке человека. Рак Летт. 2002; 180:55–61. [PubMed] [Академия Google]
5. Linghu H, et al. Участие адапторного белка Crk в злокачественных свойствах клеточной линии рака яичников человека MCAS. Онкоген. 2006; 25:3547–3556. [PubMed] [Google Scholar]
6. Shishido T, et al. Адаптерные белки семейства Crk трансактивируют киназу c-Abl.
Клетки генов. 2001; 6: 431–40. [PubMed] [Google Scholar]
7. Sirvent A, Benistant C, Roche S. Цитоплазматическая передача сигналов тирозинкиназой c-Abl в нормальных и раковых клетках. Биол Клетка. 2008; 100: 617–31. [PubMed] [Академия Google]
8. Feller SM, Knudsen B, Hanafusa H. Киназа c-Abl регулирует связывающую белок активность c-Crk. EMBO J. 1994; 13: 2341–51. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
9. Songyang Z, et al. Домены Sh3 распознают специфические последовательности фосфопептидов. Клетка. 1993; 72: 767–78. [PubMed] [Google Scholar]
10. Wu X, et al. Структурная основа специфического взаимодействия лизинсодержащих богатых пролином пептидов с N-концевым доменом Sh4 c-Crk. Структура. 1995; 3: 215–26. [PubMed] [Академия Google]
11. Саркар П., Райхман С., Салех Т., Бирге Р.Б., Калодимос К.Г. Цис-транс-изомеризация пролина контролирует аутоингибирование сигнального белка. Мол Ячейка. 2007; 25: 413–26. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
12.
Kobashigawa Y, et al. Структурная основа трансформирующей активности сигнального адапторного белка CRK, связанного с раком человека. Nat Struct Mol Biol. 2007; 14: 503–10. [PubMed] [Google Scholar]
13. Reichman C, et al. Для трансактивации Abl адаптерным белком Crk II требуется последовательность PNAY в С-концевом домене Sh4 Crk. Онкоген. 2005; 24:8187–99. [PubMed] [Google Scholar]
14. Akakura S, et al. С-концевой домен Sh4 CrkII регулирует сборку и функцию DOCK180/ELMO Rac-GEF. J Cell Physiol. 2005; 204: 344–51. [PubMed] [Google Scholar]
15. Kizaka-Kondoh S, Matsuda M, Okayama H. Сигналы CrkII от рецептора эпидермального фактора роста к Ras. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93:12177–82. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
16. Ogawa S, et al. С-концевой домен Sh4 мышиного белка c-Crk отрицательно регулирует тирозин-фосфорилирование Crk-ассоциированного p130 в клетках крысы 3Y1. Онкоген. 1994;9:1669–78. [PubMed] [Google Scholar]
17.
Николсон Л.К., Лу КП. Цис-транс-изомеризация пролила как молекулярный таймер в передаче сигналов Crk. Мол Ячейка. 2007; 25: 483–5. [PubMed] [Google Scholar]
18. Исаков Н. Новый поворот в адапторных белках способствует регуляции передачи сигналов лимфоцитами. Тренды Иммунол. 2008; 29: 388–96. [PubMed] [Google Scholar]
19. Лу К.П., Финн Г., Ли Т.Х., Николсон Л.К. Цис-транс-изомеризация пролила как молекулярный таймер. Nat Chem Biol. 2007;3:619–29. [PubMed] [Google Scholar]
20. Андреотти А.Х. Изомеризация пролина в нативном состоянии: внутренний молекулярный переключатель. Биохимия. 2003;42:9515–24. [PubMed] [Google Scholar]
21. Готель С.Ф., Марахиэль М.А. Пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы, надсемейство повсеместно распространенных катализаторов сворачивания. Cell Mol Life Sci. 1999; 55: 423–36. [PubMed] [Google Scholar]
22. Бразин К.Н., Маллис Р.Дж., Фултон Д.Б., Андреотти А.Х. Регуляция тирозинкиназы Itk пептидил-пролилизомеразой циклофилином A.
Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99: 1899–904. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
23. Wulf G, Finn G, Suizu F, Lu KP. Изомеризация пролила, специфичная для фосфорилирования: есть ли основная тема? Nat Cell Biol. 2005; 7: 435–41. [PubMed] [Google Scholar]
24. Pastorino L, et al. Пролилизомераза Pin1 регулирует процессинг белка-предшественника амилоида и продукцию бета-амилоида. Природа. 2006; 440: 528–34. [PubMed] [Google Scholar]
25. Calabrese MF, Eakin CM, Wang JM, Miranker AD. Регулируемый переключатель опосредует самоассоциацию в иммуноглобулиновой складке. Nat Struct Mol Biol. 2008;15:965–71. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
26. Lummis SC, et al. Цис-транс-изомеризация пролина открывает пору нейротрансмиттер-управляемого ионного канала. Природа. 2005; 438: 248–52. [PubMed] [Google Scholar]
27. Nelson CJ, Santos-Rosa H, Kouzarides T. Изомеризация пролина гистона h4 регулирует метилирование лизина и экспрессию генов.
Клетка. 2006; 126: 905–16. [PubMed] [Google Scholar]
28. Wang Z, et al. Изомеризация Pro в кассете MLL1 PHD3-bromo связывает считывание h4K4me с репрессией, опосредованной CyP33 и HDAC. Клетка. 2010; 141:1183–94. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
29. Eckert B, Martin A, Balbach J, Schmid FX. Изомеризация пролила как молекулярный таймер фаговой инфекции. Nat Struct Mol Biol. 2005; 12: 619–23. [PubMed] [Google Scholar]
30. Franke EK, Yuan HE, Luban J. Специфическое включение циклофилина А в вирионы ВИЧ-1. Природа. 1994; 372: 359–62. [PubMed] [Google Scholar]
31. ОуЯнг Б., Почапский С.С., Данг М., Почапский Т.С. Функциональный переключатель пролина в цитохроме P450cam. Структура. 2008;16:916–23. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
32. Vogel M, Bukau B, Mayer MP. Аллостерическая регуляция шаперонов Hsp70 с помощью пролинового переключателя. Мол Ячейка. 2006; 21: 359–67. [PubMed] [Google Scholar]
33. Северин А.
, Джозеф Р.Э., Бойкен С., Фултон Д.Б., Андреотти А.Х. Изомеризация пролина предварительно организует домен Itk Sh3 для связывания с доменом Itk Sh4. Дж Мол Биол. 2009; 387: 726–43. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
34. Muralidharan V, et al. Структура раствора и характеристики фолдинга С-концевого домена Sh4 c-Crk-II. Биохимия. 2006; 45:8874–8884. [PubMed] [Академия Google]
35. Палмер А.Г., 3-я ЯМР характеристика динамики биомакромолекул. Chem Rev. 2004; 104:3623–40. [PubMed] [Google Scholar]
36. Миттермайер А., Кей Л.Е. Новые инструменты позволяют по-новому взглянуть на ЯМР-исследования динамики белков. Наука. 2006; 312: 224–8. [PubMed] [Google Scholar]
37. Knudsen BS, et al. Требования к аффинности и специфичности для первого домена гомологии Src 3 белков Crk. EMBO J. 1995; 14: 2191–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
38. Ren R, Ye ZS, Baltimore D. Протеин-тирозинкиназа Abl выбирает адаптер Crk в качестве субстрата, используя сайты связывания Sh4.
Гены Дев. 1994; 8: 783–95. [PubMed] [Google Scholar]
39. Маллис Р.Дж., Бразин К.Н., Фултон Д.Б., Андреотти А.Х. Структурная характеристика управляемого пролином конформационного переключателя в домене Itk Sh3. Nat Struct Biol. 2002; 9: 900–5. [PubMed] [Google Scholar]
40. Rosen MK, et al. Прямая демонстрация внутримолекулярного взаимодействия Sh3-фосфотирозин в белке Crk. Природа. 1995;374:477–9. [PubMed] [Google Scholar]
41. Дональдсон Л.В., Гиш Г., Поусон Т., Кей Л.Е., Форман-Кей Д.Д. Структура регуляторного комплекса, включающего домен Abl Sh4, домен Crk Sh3 и фосфопептид Crk. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99:14053–8. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
42. Mayer BJ, Hamaguchi M, Hanafusa H. Новый вирусный онкоген со структурным сходством с фосфолипазой C. Nature. 1988; 332: 272–5. [PubMed] [Google Scholar]
43. Zvara A, et al. Активация сигнального пути киназы фокальной адгезии за счет структурных изменений в карбоксиконцевой области c-Crk II.
Онкоген. 2001;20:951–61. [PubMed] [Google Scholar]
44. Li SS. Специфичность и универсальность Sh4 и других доменов распознавания пролина: структурная основа и значение для передачи клеточного сигнала. Биохим Дж. 2005; 390:641–53. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
45. Vaynberg J, et al. Структура сверхслабого белок-белкового комплекса и его решающая роль в регуляции морфологии и подвижности клеток. Мол Ячейка. 2005; 17: 513–23. [PubMed] [Google Scholar]
46. Бакс А., Гришаев А. ЯМР слабого выравнивания: ястребиный взгляд на биомолекулярную структуру. Curr Opin Struct Biol. 2005; 15: 563–70. [PubMed] [Академия Google]
47. Попович Н., Ценг С.Р., Тонелли М., Эбрайт Р.Х., Калодимос К.Г. Структурная основа цАМФ-опосредованного аллостерического контроля белка-активатора катаболита. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106: 6927–32. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
48. Schwieters CD, Kuszewski JJ, Clore MG. Использование Xplor-NIH для определения молекулярной структуры методом ЯМР.
Прогресс в спектроскопии ядерного магнитного резонанса. 2006; 48:47–62. [Google Scholar]
49. Корнилеску Г., Делаглио Ф., Бакс А. Угол остова белка препятствует поиску в базе данных химического сдвига и гомологии последовательностей. Дж Биомол ЯМР. 1999;13:289–302. [PubMed] [Google Scholar]
50. Ценг С.Р., Калодимос К.Г. Динамическая активация аллостерического регуляторного белка. Природа. 2009; 462: 368–372. [PubMed] [Google Scholar]
Медикаментозное лечение внематочной беременности яичников: клинический случай | Журнал медицинских историй болезни
- История болезни
- Открытый доступ
- Опубликовано:
- Ozer Birge 1 ,
- Mustafa Melih Erkan 2 ,
- Ertugrul Gazi Ozbey 3 &
- …
- Deniz Arslan 3
Журнал медицинских историй болезни том 9 , номер статьи: 290 (2015) Процитировать эту статью
17 тыс.
Доступов15 цитирований
2 Альтметрика
Сведения о показателях
ДоступовAbstract
Исходная информация
Первичная яичниковая внематочная беременность — это редкий тип внематочной беременности, распространенность которого колеблется от 1:7000 до 1:70000, что составляет почти 3 % всех случаев внематочной беременности. Здесь мы сообщаем о случае 25-летней женщины, которая обратилась в нашу клинику с болями в животе, 6-недельной задержкой менструации и 3-дневным вагинальным кровотечением, у которой трансвагинальное ультразвуковое исследование показало эктопический гестационный мешок с желточным мешком внутри, в ее правый яичник.
Этот случай показывает, что ранняя диагностика очень важна, особенно в таких местах, как регион Африки к югу от Сахары.
Описание случая
В нашу клинику обратилась 25-летняя африканка с задержкой менструации на 6 недель, частыми усиливающимися болями в животе и вагинальным кровотечением в течение 3 дней. Ее общее состояние было хорошим, жизненные показатели в норме. Она чувствовала болезненность при осмотре живота и небольшое вагинальное кровотечение. Трансвагинальное УЗИ показало эктопический гестационный мешок с желточным мешком внутри, в ее правом яичнике. Нашим окончательным диагнозом была внематочная яичниковая беременность, и мы успешно вылечили ее метотрексатом. Через 3 недели приема метотрексата ее бета-хорионический гонадотропин человека был отрицательным, а ультразвуковое исследование было полностью нормальным.
Выводы
Внематочная яичниковая беременность является очень важной медицинской ситуацией.
Его следует диагностировать на ранних стадиях, иначе он может быть опасным для жизни и хирургическое лечение может быть неизбежным. Из-за важности фертильности медикаментозное лечение является приемлемым вариантом и может быть осуществимо при ранней диагностике.
Отчеты экспертной оценки
Исходная информация
Первичная внематочная беременность на яичниках — это редкий тип внематочной беременности, распространенность которого колеблется от 1:7000 до 1:70000, что составляет почти 3 % всех случаев внематочной беременности [1]. Он обычно заканчивается разрывом в первом триместре и из-за повышенной васкуляризации ткани яичника приводит к внутреннему кровоизлиянию и состоянию гиповолемического шока. Диагноз обычно ставится на основании экстренных лапаротомий и гистологического исследования.
Диагноз ставится с использованием критериев Шпигельберга [2], которые включают:
- а.
Плодное яйцо расположено в области яичника.
- б.
Внематочная беременность прикрепляется к матке связкой яичника.
- в.
Яичниковая ткань в стенке плодного яйца доказана гистологически.
- д.
Трубка на пораженной стороне не повреждена.
Нетрубная беременность является наиболее распространенным типом внематочной беременности, а яичниковая беременность является вторым наиболее распространенным типом; яичниковая беременность очень распространена при использовании внутриматочных спиралей (ВМС). В этих случаях часто проводят хирургическое лечение из-за позднего появления клинических симптомов, что приводит к поздней диагностике [1, 2].
Лечение метотрексатом (MTX) можно использовать для пациентов на ранних стадиях, если их состояние стабильно.
Представление клинического случая
В нашу клинику обратилась 25-летняя африканская женщина с ожирением и двумя кесаревыми сечениями в анамнезе с задержкой менструации на 6 недель, частыми усиливающимися болями в животе и вагинальными кровотечениями в течение 3 дней. До появления симптомов у нее были регулярные менструации. В ее истории болезни не было записей об использовании ВМС, эндометриозе или воспалительных заболеваниях органов малого таза. Это была ее третья самопроизвольная беременность, абортов не было. Общее состояние было хорошим, жизненные показатели в норме: артериальное давление 110/70 мм рт.ст., пульс 70 ударов в минуту (уд/мин), температура 36,5°С. Физикальное обследование показало минимальную болезненность со всех сторон живота с увеличением правого нижнего отдела таза. При осмотре в зеркалах выявлено небольшое кровотечение из шейки матки, пальпируемое образование в прямокишечно-маточной полости, повышение температуры и болезненность в правой придаточной области.
Трансвагинальное УЗИ (УЗИ) показало пустую полость матки толщиной 11 мм. Однако было замечено, что ее прямокишечно-маточная полость заполнена гетерогенной жидкостью, включая перегородки и гиперэхогенные области, которые, как предполагалось, представляли собой коагулянт. Эктопический гестационный мешок и желточный мешок, по-видимому, находились внутри ее правого яичника и были идентифицированы близко к средней линии, что коррелировало с ее 6-недельной задержкой менструации (рис. 1). Плод и сердцебиение плода четко не просматриваются. Вокруг плодного яйца была обнаружена сосудистая пролиферация, называемая «огненным кольцом», которая типична для внематочной яичниковой беременности (рис. 1). Ее левый яичник и маточные трубы казались нормальными. Она заявила, что ее предыдущие менструации были регулярными, но последняя менструация была 2 месяца назад. Лабораторный анализ показал количество лейкоцитов (WBC) 11 600/мм 9 .0019 3 , число эритроцитов (RBC) 400000/мм 3 , гемоглобин (Hb) 12,3 г/дл, гематокрит (Htc) 36 %, бета-хорионический гонадотропин человека (HCG) 6580 и нормальные результаты анализа мочи .
Ей поставили диагноз внематочная беременность и госпитализировали. Она и ее семья были проинформированы о стабильности состояния и, учитывая ее историю двух предыдущих кесаревых сечений, было запланировано медикаментозное лечение метотрексатом. Была введена однократная доза 90 мг метотрексата внутримышечно. Она была стабильной. Прогрессирующее снижение уровня бета-ХГЧ (4310 на четвертый день, 2190 на седьмой день, 210 на 14-й день), а также наблюдалось уменьшение внутрибрюшной жидкости и значительная регрессия ее правого яичникового мешка, и она была выписана с рекомендацией о еженедельном контрольном тесте на бета-ХГЧ. На третьей неделе после лечения метотрексатом ее уровень бета-ХГЧ был ниже 5, а внутрибрюшная жидкость почти исчезла (рис. 2).
Ультразвуковые изображения плодного яйца яичников до медикаментозной терапии метотрексатом. ( a ) Яичник плодного яйца ( b ) Цветное допплеровское изображение плодного яйца
Полноразмерное изображение
Рис.
2 Контрольное УЗИ после лечения метотрексатом
Полноразмерное изображение
Обсуждение
Человечество асептическая беременность. Первая успешная операция по поводу внематочной беременности была проведена в 1759 году в США, но обычное лечение оставалось медикаментозным до 1800-х годов, при этом материнская смертность достигала 60 % [3]. Особое внимание привлекли высокие показатели смертности, что привело к важным изменениям в диагностике и лечении этого состояния. Сальпингэктомия, которую начали выполнять с 1800-х годов, считается спасительной, поскольку снизила уровень материнской смертности почти до 5 %.
Яичниковая внематочная беременность — редкий вариант внематочной беременности [4]. Это происходит путем оплодотворения яйцеклетки, оставшейся в брюшной полости, что приводит к имплантации на поверхность яичника [5]. У женщин с внематочной беременностью яичников обычно отмечаются боли внизу живота, нарушения менструального цикла, как и при других внематочных состояниях, и киста желтого тела.
Хотя ранняя диагностика и раннее лечение имеют решающее значение, предоперационная, а иногда и интраоперационная диагностика затруднена. Диагноз обычно ставится на основании патологической оценки, поэтому критерии Шпигельберга очень важны для диагностики внематочной яичниковой беременности [6].
Предварительный диагноз обычно подтверждается повышенным уровнем бета-ХГЧ. Текущие данные сообщают, что большинство случаев происходит в первом триместре. Ранний разрыв может привести к массивному внутрибрюшному кровотечению, приводящему к гиповолемии, которая может быть опасной для жизни. Также задокументированы некоторые редкие случаи, достигающие второго триместра [7]. Опубликованы также случаи двуяйцевидной внематочной беременности и совпадения маточной и яичниковой внематочной беременности [7–10]. Мы также нашли несколько статей о внематочной беременности на поздних сроках беременности, диагностированных до операции с помощью УЗИ и магнитно-резонансной томографии (МРТ) [7, 11]. В исследовании Hallat дооперационный диагноз был установлен в 28 % из 25 случаев первичной внематочной беременности.
Все остальные случаи были диагностированы патологоанатомическим исследованием после операции [12]. Phupong и Ultchaswadi заявили, что оценка бета-ХГЧ вместе с трансвагинальным УЗИ может быть полезной для ранней диагностики [13].
Причина аномалий имплантации яичников при внематочной беременности не ясна [7, 12, 13]. Существуют различные гипотезы, такие как:
- а.
Задержка выхода яйцеклетки.
- б.
Утолщение белочной оболочки.
- в.
Трубная дисфункция.
- д.
Средства внутриматочной контрацепции (например, ВМС).
Воспалительные заболевания органов малого таза не влияют на яичниковую внематочную беременность, как на трубную беременность [9]., 14]. Согласно большинству исследований, ВМС считаются основным фактором внематочной беременности яичников. Считается, что ВМС вызывают легкое воспаление, которое нарушает цилиарную активность эндосальпинкса и приводит к задержке транспорта яйцеклетки и эктопической имплантации [15, 16]. В нашем случае внематочная беременность была диагностирована на основании клинико-лабораторных исследований и оценки ее состояния. В связи с двумя предыдущими кесаревыми сечениями и подозрением на вторичный сальпингит из-за эндемических хронических инфекций органов малого таза мы провели лечение метотрексатом.
Первичная внематочная яичниковая беременность обычно наблюдается у молодых фертильных повторнородящих женщин, использующих ВМС [17]. Бергер и Блехнер документально подтвердили, что соотношение внематочной беременности из-за яичников среди женщин, использующих ВМС, ко всем случаям внематочной беременности составляет 1:9; его распространенность в общей популяции определяется как 1:150 на 200 [16].
В нашем случае не было истории использования ВМС. В серии случаев Raziel et al в 18 из 20 случаев яичниковой беременности использовались ВМС [14]. Связь между ВМС и яичниковой беременностью у фертильных пациенток заслуживает внимания. В своем исследовании Lehfeldt и др. . обнаружили, что ВМС предотвращают имплантацию в матку на 99,5 % и трубную имплантацию на 95,5 %; однако профилактического эффекта при имплантации яичников нет [18].
Поскольку окончательный диагноз ставится хирургическим путем и гистопатологически даже у пациентов с ранним началом, хирургические вмешательства имеют как диагностическое, так и терапевтическое значение. Поскольку овариэктомия является радикальной процедурой при внематочной беременности яичников, следует учитывать возраст пациентки, фертильность, ее желание иметь дальнейшую беременность и размер новообразования; Клиновидная резекция также может быть еще одним хирургическим вариантом.
Медикаментозное и консервативное лечение также было внедрено в последние годы для предотвращения потери ткани яичников, тазовых спаек и сохранения фертильности пациентки.
К ним относятся введение мифепристона для пациентов, у которых диагноз был поставлен с помощью трансвагинального УЗИ, парентеральное лечение простагландином F2a и лечение метотрексатом для случаев без разрыва, обнаруженных с помощью лапароскопии [11, 19]. Пагидас и Фришман провели лечение метотрексатом при эктопии яичников, диагностированной с помощью трансвагинального УЗИ, и добились излечения. Они подчеркнули, что в случаях ранней стадии, диагностированных с помощью трансвагинального УЗИ, может помочь лечение метотрексатом [20]. Ди Луиджи и др. также провел и успешно провел многократную терапию метотрексатом, которую они назначили 37-летнему пациенту с двумя предыдущими кесаревыми сечениями и использованием ВМС в анамнезе; ей поставили диагноз внематочной яичниковой беременности на 6 неделе с помощью трансвагинального УЗИ. Они подчеркнули, что при тщательной клинической оценке и трансвагинальном обследовании эктопию яичников на ранней стадии можно лечить медикаментозно, сохраняя нормальную анатомию, имеющую решающее значение для фертильности [21].
Обзор данных показывает, что лечение метотрексатом выбирают после четкого диагноза и выявления локализации эктопических случаев с помощью лапароскопии, и поэтому лапароскопия объявляется вспомогательной диагностической процедурой [22]. В случаях, когда размер плодного яйца меньше 30 мм, отсутствует сердечная деятельность плода и возраст менее 6 недель, лечение метотрексатом особенно рекомендуется и превосходит хирургическое вмешательство, поскольку оно не нарушает фертильность [23].
В нашем случае, хотя у нее была тазовая жидкость геморрагического характера, которая могла быть вызвана разрывом таза, клиническая оценка и рассмотрение ее предыдущих операций привели к тому, что мы лечили ее медикаментозно. Уровни ее бета-ХГЧ постепенно снижались после однократной дозы метотрексата, и она не сталкивалась с риском дальнейшего хирургического вмешательства.
Выводы
Хотя внематочная беременность яичников является редким состоянием, после тщательной оценки выбор медицинских процедур должен учитывать сохранение фертильности, особенно у молодых пациенток.
Согласие
От пациента было получено письменное информированное согласие на публикацию этого отчета о клиническом случае и любых сопутствующих изображений. Копия письменного согласия доступна для ознакомления главному редактору этого журнала.
Сокращения
- ХГЧ:
Хорионический гонадотропин человека
- ВМС:
Внутриматочная спираль
- MTX:
Метотрексат
- USG:
УЗИ
Ссылки
Маркус С.М., Brinsden PR. Первичная яичниковая беременность после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов: отчет о семи случаях. Фертил Стерил. 1993; 60: 167–70.
КАС Статья пабмед Google ученый
Gerin-Lajoie L. Яичниковая беременность. Am J Obstet Gynecol. 1951; 62: 920–9.
КАС Статья пабмед Google ученый
Даймонд М.П., ДеЧерный А.Х. Внематочная беременность. УБ Сондерс. 1991; 163: 780–804.
Google ученый
Аль-Мешари А.А., Чоудхури Н., Аделуси Б.Х. Яичниковая беременность. Int J Gynaecol Obstet. 1993;41(3):269–72.
КАС Статья пабмед Google ученый
Штурм Дж.Т., Хэнкинс Д.Г., Мало Дж.В., Цицерон Дж.Дж. Яичниковая внематочная беременность. Энн Эмерг Мед. 1984; 13: 362–4.
КАС Статья пабмед Google ученый
Стэнли Дж. Р., Харрис А. А., Гилберт С. Ф., Леннон Ю. А., Деллинджер Э. Х. Магнитно-резонансная томография в оценке яичниковой двойни во втором триместре беременности. Акушерство Гинекол. 1994; 84: 648–51.
КАС пабмед Google ученый
Панда Дж.К. Первичная яичниковая двойня. История болезни. Br J Obstet Gynecol. 1990; 97: 540–1.
КАС Статья Google ученый
Бернабеи А., Морганте Г., Мадзини М., Геррини Э., Фава А., Данеро С. Одновременная яичниковая и внутриматочная беременность: история болезни. Am J Obstet Gynecol. 1992; 167: 134–5.
КАС Статья пабмед Google ученый
Левин Дж. Х., Лакарра М., д’Аблаинг Г., Граймс Д. А., Вермеш М. Неэффективность мифепристона (RU 486) при гетеротопической беременности яичников. Am J Obstet Gynecol. 1990; 163: 543–4.
КАС Статья пабмед Google ученый
Hallat J. Первичная яичниковая беременность. Отчет о двадцати пяти случаях. Am J Obstet Gynecol. 1982; 143: 50–60.
Google ученый
Phupong V, Ultchaswadi P. Первичная яичниковая беременность. J Med Assoc Thai. 2005; 88 (4): 527–9..
ПабМед Google ученый
Разиэль А., Голан А., Пански М., Рон-Эл Р.
, Буковский И., Каспи Е. Яичниковая беременность: отчет о двадцати случаях в одном учреждении Отчет о случаях. Am J Obstet Gynecol. 1990; 163:1182–5.КАС Статья пабмед Google ученый
Гербертссон Г., Магнуссон С., Бенедиктсдоттир К. Беременность яичников и использование ВМС в определенной полной популяции. Acta Obstet Gynecol Scand. 1987;66:607–10.
КАС Статья пабмед Google ученый
Бергер Б., Блехнер Дж. Н. Яичниковая беременность, связанная с внутриматочной спиралью на основе меди-7. Акушер Гинекол. 1978; 52: 597–600.
КАС Google ученый
Шварц Л.Б., Карканджиу М.Л., ДеЧерни AHX. Первичная яичниковая беременность: клинический случай. J Reprod Med. 1993; 38: 155–8.
КАС пабмед Google ученый
Шамма Ф.Н., Шварц Л.Б. Первичная яичниковая беременность успешно лечится метотрексатом. Am J Obstet Gynecol. 1992; 167:1307–8.
КАС Статья пабмед Google ученый
Пагидас К., Фришман Г.Н. Нехирургическое ведение первичной яичниковой беременности с трансвагинальным местным введением метотрексата под ультразвуковым контролем. J Миним инвазивный гинекол. 2013;20(2):252–4.
Артикул пабмед Google ученый
Di Luigi G, Patacchiola F, La Posta V, Bonitatibus A, Ruggeri G, Carta G. Ранняя яичниковая беременность, диагностированная с помощью УЗИ и успешно вылеченная многократными дозами метотрексата.
Отчет о случае. Clin Exp Obstet Gynecol. 2012;39(3): 390–3.ПабМед Google ученый
Хелмов Д., Гейтс Е., Пензиас А.С. Лапароскопическая диагностика и лечение метотрексатом яичниковой беременности: клинический случай. Фертил Стерил. 1994;62(4):879–81.
КАС Статья пабмед Google ученый
Аннунциата Н., Малиньино Э., Зарконе Р. Лечение яичников при беременности метотрексатом. Панминерва Мед. 1996;38(3):190–2.
КАС пабмед Google ученый
«>Шпигельберг ОКС. Zur casuistic der ovarial schwangerschaft. Арка Гинекол. 1978;13:73.
Артикул Google ученый
«>Калфаян Б., Гундерсен Дж.Х. Беременность яичниковой двойней. Отчет о случае. Акушерство Гинекол. 1963; 21: 126–8.
Google ученый
, Буковский И., Каспи Е. Яичниковая беременность: отчет о двадцати случаях в одном учреждении Отчет о случаях. Am J Obstet Gynecol. 1990; 163:1182–5.
«>Lehfeldt H, Tietze C, Gorstein F. Яичниковая беременность и внутриматочная спираль. Am J Obstet Gynecol. 1970; 108 (7): 1005–109.
КАС Статья пабмед Google ученый
Отчет о случае. Clin Exp Obstet Gynecol. 2012;39(3): 390–3.Загрузить ссылки
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить персонал турецкой исследовательской и учебной больницы Ньяла Судан, пациента и родственников, которые любезно дали свое согласие на публикацию этого клинического случая.
Информация об авторе
Авторы и организации
Ньяла, Судан, Турция Учебно-исследовательский госпиталь, отделение гинекологии и акушерства, округ Западная Алезза, Южная Ньяла, Дарфур, Судан
Ozer Birge
Университетская больница Celal Bayar, отделение акушерства и гинекологии, Маниса, Турция
Mustafa Melih Erkan
Nyala, Судан, Турция Учебно-исследовательский госпиталь, отделение урологии, Nyala 90, 002 Судан, Nyala Эртугрул Гази Озбей и Дениз Арслан
Авторы
- Озер Бирге
Посмотреть публикации автора
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия
- Мустафа Мелих Эркан
Просмотр публикаций автора
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar
- Ertugrul Gazi Ozbey
Просмотр публикаций автора
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar
- Дениз Арслан
Просмотр публикаций автора
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar
Автор, ответственный за переписку
Озер Бирге.
Дополнительная информация
Конкурирующие интересы
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Вклад авторов
BO, AD и OEG принимали участие в лечении пациента. BO и EMM составили рукопись. EMM и BO предоставили ценный вклад и рекомендации во время подготовки рукописи. BO отвечал за общее ведение пациента и критически контролировал написание. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
Права и разрешения
Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение, и воспроизведение на любом носителе, при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от права Creative Commons на общественное достояние (http://creativecommons.
org/publicdomain/zero/1.0/) применяется к данным, представленным в этой статье, если не указано иное.
Перепечатки и разрешения
Об этой статье
Эбби Эммонс — Как добавить халяву к сообщениям в блоге + Получить подписку по электронной почте
Бесплатные подарки — это здорово. Будь то распечатка, контрольный список, шаблон, анкета, ЧТО-НИБУДЬ — люди любят бесплатные вещи. И к счастью для них, мы, блоггеры, такие как
, делаем бесплатных вещей. Но мы хотим чего-то взамен… например, подписчиков на электронную почту!Нет ничего плохого в том, чтобы хотеть больше подписчиков электронной почты — это просто дает вам больше возможностей изменить жизнь ваших читателей своим потрясающим контентом. Больше регистраций по электронной почте = ОЧЕНЬ ХОРОШО. Но не всегда легко включить людей в свои списки, верно?
Вот тут-то и появляются бесплатные подарки. Несколько недель назад я говорил о том, как создать идеальный пост в блоге, и в этой статье я упомянул об обновлении контента (иначе называемом бесплатным) для ваших читателей.
По сути, это «следующий логический шаг» для того, кто только что прочитал ваш пост. Например, если вы написали пост о тайм-менеджменте, возможно, вы бы добавили в конце своего поста печатную форму, в которой описывается метод или расписание тайм-менеджмента.
Бесплатный подарок не только помогает читателю выйти на новый уровень и действительно улучшить его жизнь, но и делает вас более запоминающимся для него. И если вы получите их адрес электронной почты, вы сможете общаться с ними снова и снова, предлагая то, что вы можете предложить, и получая подписчиков в процессе! Звучит как беспроигрышный вариант, верно?
ДА. ЭТО ДЕЙСТВИТЕЛЬНО ТАК. Итак, сегодня я собираюсь показать вам техническую сторону этого; как я делаю халяву, настраиваю список адресов электронной почты и создаю форму подписки, которая делает товары легко доступными для ваших читателей. (И заставляет их возвращаться снова и снова.
) Поехали!
Шаг 1: Создайте свою халяву
Это самая забавная часть: создание вашей халявы. Как я уже говорил, это может быть что угодно: контрольный список, распечатка, шаблон, рабочий лист, даже постер или цитата. Постарайтесь сделать его как можно более полезным, чтобы читатели были очень рады получить его в свои руки.
Спросите себя: «Каков следующий логический шаг моего читателя?» и посмотрите, что у вас получится.
Что касается создания настоящей халявы, мне нравится использовать Canva, поскольку она позволяет сохранять документ в формате PDF и имеет возможность сделать документ многостраничным. В Canva также есть сотни готовых шаблонов на выбор. Так что, если вы хотите сделать красивый рабочий лист, но не знаете, как приступить к его созданию, они помогут вам. Просто выберите шаблон и настройте его по своему вкусу!
Когда вы закончите разработку своей халявы, загрузите ее на свой компьютер в формате PDF и убедитесь, что она сохранена там, где ее легко найти.
Шаг 2. Создайте список адресов электронной почты
Если у вас уже есть список адресов электронной почты для подписчиков вашего блога, отлично. НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ ЭТО. Не для этого. Что мне нравится делать с халявой, так это создавать отдельный «тематический» список для каждой печатной формы. Что я имею в виду? По сути, я составляю списки адресов электронной почты в соответствии с ТЕМОЙ обновления контента, а не просто добавляю всех в один список. Почему? Потому что это очень простой способ организовать своих подписчиков и предоставлять им только тот контент, который, как вы знаете, они будут копать.
Вот что раздражает, многие блоггеры ошибаются с подпиской. Вы соглашаетесь на что-то вроде бесплатных стоковых фотографий и попадаете в их общий список адресов электронной почты, что означает, что вы получаете ВСЕ их электронные письма — от того, как продать электронную книгу, до того, как организовать гардероб.
Ничего общего со стоковыми фотографиями, которые вы изначально выбрали.
Вот почему я люблю составлять отдельные списки для каждой халявы. Если я раздаю распечатку, связанную с ведением блога/бизнесом, то я не хочу посылать этим людям статью о написании историй. Я хочу отправлять им контент, который будет лучше соответствовать их потребностям, и поддерживать их подписку.
Итак, зайдите в MailChimp и создайте новый список. Если вы не используете службу автоматизации электронной почты, такую как MailChimp, ВАМ НУЖНО. Серьезно, это бесплатно до 2000 подписчиков, и, на мой взгляд, это необходимо, если вы хотите вывести свой блог и бренд на новый уровень. Бонус: это СУПЕР просто в использовании.
Назовите свой список адресов электронной почты как-то, что соответствует типу контента, который вы будете отправлять своим подписчикам — чтобы все были организованы. В конечном итоге это будет список не только одной халявы, но и КАЖДОЙ халявы, попадающей в эту категорию.
Шаг 3: Заполните регистрационную форму
Для этого шага я записал для вас небольшое видео-пошаговое руководство (потому что я не хочу включать миллион скриншотов, лол). Но здесь нет звука, поэтому вы можете смотреть его в любое время и в любом месте. . В приведенном ниже видео я покажу вам, как я составляю список, делаю форму подписки для этого списка и добавляю ссылку на халяву на другой стороне процесса регистрации.
Если вы когда-либо изучали возможность обновления контента, вы, возможно, видели, как люди рассылают бесплатные подарки своим подписчикам через «приветственное письмо». Это означает, что как только человек подписывается на вашу рассылку, на его почтовый ящик автоматически отправляется электронное письмо с халявой.
Но я не люблю так делать, по многим причинам (приветственное письмо попало в папку со спамом, а подписчики не могут его найти! нехорошо!)
Итак, что я предпочитаю делать (и что вы увидите пошаговое видео) содержит ссылку на скачивание PDF-файла на странице подтверждения с благодарностью. Таким образом, читатель все еще должен подписаться, чтобы получить халяву, но ему не нужно ждать, пока она появится в его почтовом ящике.
Это также дает вам возможность настроить другое приветственное письмо, которое не так срочно. Например, в моем списке сериалов по прокачке персонажа (список, который вы видите в видео) у меня настроена автоматизация приветственной электронной почты, так что подписчики получают два других видео из моей серии про прокачку персонажа через 1 час после того, как они подписался на бесплатный PDF-файл.
Шаг 4. Добавьте форму регистрации в сообщение в блоге
Очевидно, что это самая важная часть — вставить новую блестящую форму регистрации в сообщение в блоге и заставить людей зарегистрироваться! Мне нравится размещать ссылки на форму в нескольких местах, а также добавлять красивое изображение, на которое читатели не могут не нажать.
Волшебную ссылку на вашу регистрационную форму можно найти прямо здесь, в MailChimp (когда вы находитесь на странице конструктора форм):
Шаг 5: Поддерживайте, поддерживайте, промывайте, повторяйте
Поздравляем! Вы успешно создали грандиозную халяву, список адресов электронной почты, форму регистрации и добавили ее в свой пост в блоге. Ваши последователи будут в восторге. Но теперь вы можете задать себе вопрос:
Что я могу дать этим подписчикам, когда они у меня появятся?
Что ж, после прочтения этого поста вы должны знать, что не давать им: все, что не имеет к ним отношения или не похоже на контент, который они выбрали. < это верный способ потерять подписчиков. Если вы хотите сохранить их в своем списке, , вы должны воспитывать их контентом, который, как вы знаете, им понравится.
Скорее всего, у вас уже есть тонны этого материала в ваших архивах. Отправляйте им качественный контент не реже двух раз в месяц, а то и раз в неделю.
Не надоедай, но и не стесняйся! Если им понравился этот пост в блоге достаточно, чтобы получить от него халяву, им понравится все, что у вас есть по этой теме.
Воспитание так важно, потому что оно держит вашу аудиторию «теплой» и готовой потреблять больше вашего контента — возможно, даже заплатить за часть этого. Если вы собираетесь предлагать продукт или услугу в будущем, эти списки будут золотыми — они будут заполнены потенциальными покупателями и клиентами. Не смотрите на это так, будто вы обманываете их, чтобы они стали вашими потенциальными клиентами. Вместо этого посмотрите, как оно есть: вы оказываете ИМ услугу. Вы улучшаете их жизнь своим контентом! И они улучшают вашу жизнь, поддерживая ваши усилия заниматься любимым делом.
Так что вперед, делайте классные подарки и получайте подписки по электронной почте на автопилоте!
ПОГОВОРИТЕ, БРО
Вы когда-нибудь делали бесплатное обновление/обновление контента для сообщения в блоге? Какая ваша любимая платформа для создания бесплатных и печатных материалов? Вы взволнованы, чтобы сделать халяву после прочтения этого поста?! Я надеюсь, что это так.