+7 (495) 720-06-54
Пн-пт: с 9:00 до 21:00, сб-вс: 10:00-18:00
Мы принимаем он-лайн заказы 24 часа*
 

Ооо скол: ООО «Скол» Владимир (ИНН 3328434935) адрес, официальный сайт и телефон

0

Евросоюз внес в черный список авиакомпанию из Калининградской области | ОБЩЕСТВО

Российской авиакомпании «Скол», зарегистрированной как резидент ОЭЗ в Калининградской области, запрещено летать в страны Евросоюза.

Сообщение об этом опубликовано на сайте Европейской Комиссии.

В «черный» список авиакомпании попадают в том случае, если их деятельность не соответствует принципам обеспечения наивысшего уровня безопасности полетов для европейцев и всех других пассажиров, путешествующих в Европейский Союз и внутри него.

Согласно последнему обновлению списка, 97 авиакомпаниям запрещены полеты в небо Евросоюза.

«Поддержание наивысшего уровня безопасности для всех авиапассажиров и персонала является главным приоритетом. Список безопасности полетов ЕС остается одним из наших самых эффективных инструментов для достижения этой цели. Я особенно рад, что после двух лет напряженной работы мы сегодня можем исключить всех авиаперевозчиков из Молдовы из этого списка, открывая им дверь для повторного полета в ЕС.

Это показывает, что упорный труд и тесное сотрудничество окупаются», — подчеркнул комиссар по транспорту Адина Вэлеан.

Так, из нынешнего варианта списка были исключены авиакомпании Молдовы.

ООО «Авиакомпания «СКОЛ» создана в 2000 году, зарегистрирована в городе Сургуте. В 2019 году Авиакомпания «СКОЛ» стала Резидентом особой экономической зоны (ОЭЗ) в Калининградской области.

Из-за невыполнения условий лизинга воздушных судов Росавиция в июне 2021 года запретила авиакомпании «СКОЛ» эксплуатацию 35 воздушных судов.

29 ноября 2015 года в семи километрах от посёлка Кедровый Ханты-Мансийского автономного округа разбился вертолёт Aérospatiale AS.350 Écureuil авиакомпании «СКОЛ». В результате происшествия погибли 4 человека. Вертолёт по заказу Лукойла перевозил сотрудников нефтяной компаний «РИТЕК Белоярскнефть».

21 октября 2016 года вертолёт Ми-8 авиакомпании «СКОЛ»​разбился в районе посёлка Старый Уренгой. Из находящихся на борту 22 человек — 19 погибли, 3 были госпитализированы.

Авиакомпания СКОЛ — это… Что такое Авиакомпания СКОЛ?

ООО «Авиакомпания „СКОЛ“» (SKOL Airline, LLC) — вертолетная авиакомпания, основной офис расположен в Сургуте ХМАО-Югра. Компания осуществляет вертолетные работы на территории Восточной и Западной Сибири, выполняет работы за рубежом. В России является одним из крупных операторов вертолетных перевозок. Основной аэропорты базирования — Черемшанка — Красноярск, СКОЛ — Сургут.

Коды и позывные

  • ICAO код: CDV
  • Внутренний код: СД
  • Позывной: СД

История

  • ООО «Авиакомпания „СКОЛ“» создана в 2000 году, зарегистрирована в городе Сургуте Тюменской области, в 2001 году создан филиал авиакомпании в Красноярском крае. В феврале 2001 года авиакомпанией получен сертификат эксплуатанта, имеются соответствующие лицензии на выполнение по России авиационных работ вертолетами типа Ми-26Т, Ми-8Т, Ми-8АМТ, Ми-8МТВ-1, полетов самолетом Як-40, получен международный допуск на выполнение авиационных работ вертолетом Ми-26Т.
    Создана база технического обслуживания авиационной техники имеющая сертификаты на все виды обслуживания эксплуатируемых воздушных судов.
  • Постоянными клиентами авиакомпании являются: ОАО «Сургутнефтегаз», ОАО «Газпром», ОАО «НГК „Славнефть“», ЗАО «Алроса», администрация Сургутского района ХМАО-Югры, администрации Красноярского края.
  • В 2007 году по контракту с греческой фирмой Scorpion International выполняли задачи по тушению лесных пожаров на территории республики Греция.
  • 2008 год Статус официального вертолетного перевозчика ООН по программе WFP. Гуманитарная миссия на о. Гаити.
  • 2010 год Статус официального вертолетного перевозчика ООН по программе WFP. Гуманитарная миссия в Пакистане.
  • Авиакомпания владеет вертодромом, находящимся в 37 километрах от города Сургута, в сторону Лянтора, на котором имеются оборудованные стоянки под любой тип вертолетов.
  • Красноярский филиал авиакомпании «СКОЛ» базируется в аэропорту «Черемшанка», где компания владеет зданием, в котором расположены летная и техническая службы. Постоянные представители авиакомпании находятся в Москве.

Флот

Авиапарк компании следующие типы воздушных судов:

Ссылки

Как наращивают передние зубы | процесс, фото, больно ли это

Когда требуется наращивание зубов

К процедуре следует прибегнуть: 

  • при врожденных аномалиях зубов (недоразвитости, отсутствии зубной единицы, наличии щели между зубами),

  • возрастных изменениях, повлекших отсутствие или деформацию зубов,

  • нарушении прикуса,

  • сколах зубной эмали,

  • серьезном повреждении зуба кариесом,

  • пятнах или истончении эмали.

Указанные дефекты необходимо устранять, поскольку поврежденные зубы — это причина развития воспалительных процессов.

Они возникают, потому что через сколы, трещины и кариозные полости болезнетворные микроорганизмы легко проникают вглубь тканей и провоцируют их инфицирование. 

Впрочем, у наращивания есть противопоказания: 

  • аллергия на материал,

  • прикорневые кисты,

  • патологии прикуса, исправляемые брекет-системами,

  • невылеченные стоматологические заболевания (пародонтит, стоматит),

  • бруксизм (непроизвольное скрежетание зубами).

Важно! Для некоторых пациентов противопоказанием может стать возраст старше 60 лет. Это касается людей с тяжелыми хроническими заболеваниями сердца, кровеносной системы.

Преимущества процедуры

При манипуляциях пациент не испытывает боли. Нарощенные зубы служат долго, поскольку меньше подвержены негативным факторам, а процедура занимает немного времени.

Методики наращивания зубов

Существует несколько современных методик наращивания зубов. Наиболее подходящую врач подберет после осмотра пациента. Выбор будет зависеть, в первую очередь, от степени повреждения зубов. 

Наращивание зуба пломбой

Фотополимерные материалы позволяют скорректировать небольшой скол, трещину эмали или пятно на ней. Они:

  • сочетаются с природным цветом зубов, 

  • не причиняют вреда здоровым зубным тканям и слизистой оболочке рта, 

  • позволяют точно воссоздать поврежденный участок,

  • позволяют сберечь природный слой эмали и нервы. 

Процедура доступна по цене и не займет много времени: на зубе со сколом устанавливается пломба из специального быстротвердеющего состава.

Виниры и люминиры

Применение этих тонких керамических накладок, скрывающих недостатки зуба, относится к художественному восстановлению. 

Виниры визуально увеличивают зубы. Для их установки пациенту придется посетить стоматолога не менее 2-х раз, чтобы врач: 

  1. Подобрал тип накладок.

  2. Под анестезией сточил эмаль в месте установки.

  3. Установил виниры на стоматологический цемент.

Люминиры скрывают потемневшую эмаль, сколы и трещины, маскируют большое расстояние между зубами. Они тоньше и легче виниров, их установка не требует стачивания эмали, а снятие не вредит ей. 

Наращивание зуба коронкой 

Если зуб почти полностью разрушен, предыдущие способы реставрации будут неэффективны. В этом случае врач устанавливает коронку.

Наращивание на штифт 

При серьезном разрушении зуба его наращивают на штифт. Врач:

  1. Направляет пациента на рентгеновский снимок.

  2. Вживляет в костную ткань зуба штифт — стержень из титана или стекловолокна.

  3. Формирует видимую, коронковую часть зуба. 

То, сколько стоит наращивание зуба, будет зависеть от сложности случая и выбранной методики. 

Восстановление после наращивания 

Все манипуляции врач проводит после введения анестетика, поэтому явной боли человек не чувствует. 

Неприятные ощущения могут беспокоить пациента после установки штифта или стачивания эмали под виниры. Но даже они вскоре проходят. 

Внимание! Непроходящая усиливающаяся боль говорит об осложнениях. При ее наличии нужно срочно обращаться к врачу, проводящему наращивание.


Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Неожиданный двухъядерный механизм расщепления O – O и радикальной активации C – H для катализируемой Cu десатурации лактона

Исследование теории функционала плотности катализируемой Cu десатурации δ-валеролактона до α, β-ненасыщенных аналогов обнаруживает неожиданный двухъядерный гомолиз ди- трет -бутилпероксида (DTBP) со спин-кроссовером и радикалом α-C – H механизм активации связи. Определяющей стадией реакции, катализируемой Cu I OAc-CyPPh 2 , является гомолиз связи O – O в DTBP с общим барьером свободной энергии 26.9 ккал моль −1 , что согласуется с наблюдаемыми зависимостями первого порядка от LCu I -PR 3 и DTBP, а также псевдонулевого порядка с лактоном. Шаги переноса α- и β-H имеют на 0,3 и 14,8 ккал моль -1 более низкие барьеры, чем процесс расщепления O – O, соответственно. Такие разные барьеры хорошо объясняют наблюдаемый слабый кинетический изотопный эффект (КИЭ) при α-H и отсутствие КИЭ при β-H. Кроме того, мы обнаружили, что замена CyPPh 2 на пиридин в комплексах Cu приводит к гораздо более высоким барьерам для разрыва связи O – O и активации связей C – H с образованием более стабильных биядерных комплексов Cu.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент. .. Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Ферментативное расщепление 3′-этерифицированных нуклеотидов обеспечивает длительный непрерывный синтез ДНК

Аккомодация 3′-этерифицированного dNTP большим фрагментом ДНК-полимеразы I (BF)

Bacillus stearothermophilus

Для выяснения внутренних свойств A- семейство ДНК-полимераз (AF-DNAP) и сделать вывод о том, как AF-DNAP могут легко принимать и включать 3′-этерифицированный нуклеотид (NT), мы сначала построили вычислительную модель тройного комплекса BF с ДНК праймер-матрица и 3′- этерифицированный нуклеотид на основе существующей тройной структуры BF (файл PDB: 1LV5) 31 (рис.2С). Мы выбрали BF для структурного моделирования из-за его высокой степени гомологии с другими AF-DNAP. Сравнение белковых последовательностей трех больших фрагментов ДНК-полимеразы I из Bacillus stearothemophilus (BF), Thermus aquaticus (KlenTaq) и Escherichia coli (фрагмент Кленова, KF) показывает, что BF разделяет 56% и 55% идентичности с KlenTaq и KF соответственно (данные не показаны). В дополнение к сохранению последовательности и структуры BF с другими ДНК-полимеразами A-семейства, в банке данных белков (PDB) имеются многочисленные кристаллические структуры BF, которые делают результаты вычислительных моделей более предсказуемыми.

Чтобы построить модель тройного комплекса BF в сочетании с ДНК праймер-матрица и 3′-этерифицированным dNTP, мы непосредственно заменили природный dCTP на модифицированный (2-аминоэтокси) -3-пропионил (Aep) -dCTP в закрытая конформация тройной структуры BF, содержащей праймер-матрицу ДНК и dCTP. (2-аминоэтокси) -3-пропионильная группа была выбрана из-за ее гибкости и доступности для присоединения флуоресцентного красителя (рис. 2А). Как показано на фиг. 2C, 3′-сложноэфирная группа 3′-Aep-dCTP обращена внутрь и рядом с остатком E658 BF, который, как было ранее показано, исключает модификации C2 ‘дезоксирибозы в нуклеотид-связывающей цепи. карман BF 31 .Между тем, (2-аминоэтокси) -3-пропионильная группа 3′-Aep-dCTP выступает к отверстию кармана, а три отрицательно заряженных фосфата нуклеотида остаются связанными с двумя двухвалентными катионами (Mg 2+ или Mn 2 + на рис. 2С). Наложение модели на исходный тройной комплекс BF выявляет заметный «эффект исключения» 3’-Aep-dCTP в нуклеотид-связывающем кармане BF. Больший размер 3’-Aep-dCTP вызывает значительное вращение остатка E658 и, следовательно, увеличивает расстояние между карбоксилатом боковой цепи E658 и положением C2 ’3’-Aep-dCTP от 3.От 1 до ~ 4,0 Å. Репозиция боковой цепи E658 образует альтернативную водородную связь с карбонильной группой 3′-сложного эфира 3′-Aep-dCTP (рис. 2D), которая потенциально стабилизирует 3′-Aep-dCTP в кармане для связывания нуклеотидов ( НБП) БФ. Соответственно, субдомен finger BF также переориентируется, чтобы освободить место для 3’-Aep-dCTP внутри NBP. О-спираль субдомена пальца BF вращает и сдвигает обе ароматические боковые цепи остатков F710 и Y714 от 3’-Aep-dCTP (рис. 2C). Переориентация боковых цепей F710 и Y714 слегка раскрывает О-спираль субдомена пальца и создает больше места для (2-аминоэтокси) -3-пропионильной группы, чтобы поместиться внутри NBP BF.В целом, синергетические движения сахарных ворот E658 и остатков F710 и Y714 на консервативной O-спирали субдомена пальца BF, по-видимому, играют критическую роль в принятии 3’-Aep-dCTP. Интересно, что остатки E658, F710 и Y714 BF являются высококонсервативными среди других ДНК-полимераз A-семейства (рис. 2B). Следовательно, вполне вероятно, что все эти ДНК-полимеразы A-семейства могут включать 3’-этерифицированные dNMP.

Включение 3′-Aep-dNMP с помощью BF и других ДНК-полимераз A-семейства

Чтобы проверить, могут ли BF и другие коммерчески доступные ДНК-полимеразы A-семейства (KF, Taq, Tth, Tfl и Bsu) эффективно включать 3′-этерифицированные dNMP в процессе репликации ДНК мы синтезировали все четыре основания 3′-Aep-dNTP (рис. 2А) в соответствии с ранее опубликованными процедурами 30,32 . Молекулярная масса и идентичность синтетических 3’-Aep-dNTP были измерены и подтверждены масс-спектрометрией с электрораспылением и ионизацией (ESI / MS) (Рисунок S1). Чистоту и стабильность нуклеотидов дополнительно определяли с помощью аналитической ВЭЖХ. Все четыре 3’-Aep-dNTP демонстрируют чистоту в диапазоне от 99,32% до 99,92% и стабильность от 98,75% до 99,57% после инкубации при 60 ° C в течение 1 часа (рисунок S2).

Для определения активности включения 3’-Aep-dNMP с помощью BF проводили анализы удлинения праймеров, и продукты реакции разделяли капиллярным электрофорезом, как описано в Методиках.Интенсивность флуоресценции праймерных (N) и N + 1 нуклеотидных полос измеряли с помощью анализа фрагментов ДНК. Как показано на фиг. 3A, полосы праймера (N) и N + 1 нуклеотидов (NT) показывают различные пики при анализе фрагментов ДНК, соответственно. Затем можно рассчитать относительную активность по включению NT (% от N + 1 продуктов) BF, как описано в разделе «Методы». Как показано на фиг. 3B, активность включения 3’-Aep-dCMP с помощью BF показывает зависимость концентрации нуклеотидов. Повышение концентрации 3’-Aep-dCTP с 0.125, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20-40 мкМ в реакции полимеризации ДНК соответствуют более высокой активности BF по включению NT (перевернутые, заштрихованные треугольники). Постоянная Константа Михаэлиса ( K m ) 3’-Aep-dCTP для BF может быть определена, как описано в Методиках. Результат приведен в таблице 1. Значение BF для 3’-Aep-dCTP K m было оценено как 1,50 ± 0,02 мкМ. Аналогичным образом, значения K m для пяти других коммерчески доступных ДНК-полимераз A-семейства (KF, Taq, Tth, Tfl и Bsu) также измеряли с помощью тех же экспериментальных процедур.Как показано на фиг. 3B, за исключением KF (точки), ДНК-полимеразы Taq, Tth, Tfl и Bsu демонстрируют аналогичную степень активности включения NT (закрашенные квадраты, светлые кружки, закрашенные треугольники и пустые квадраты, соответственно). KF проявляет более высокую активность по включению NT в серии концентраций 3’-Aep-dCTP, чем другие ДНК-полимеразы. В результате значение 3’-Aep-dCTP для KF K m составляет 0,28 ± 0,01 мкМ, что намного ниже, чем значения BF, Taq, Tth, Tfl и Bsu (Таблица 1).

Таблица 1 Постоянная константа Михаэлиса ( K m ) 3’-Aep-dCTP для коммерчески доступных ДНК-полимераз A-семейства.

Активность по включению NT всех четырех 3’-Aep-dNTP с помощью BF и KF была дополнительно исследована более подробно. Как показано в таблице 2, KF демонстрирует более устойчивую активность по включению NT с каждым из 3’-Aep-dNTP, чем BF в идентичных экспериментальных условиях. Значения KF K m для всех четырех 3’-Aep-dNTP равны 0.24 ± 0,01 (dA), 0,08 ± 0,01 (dT), 0,28 ± 0,01 (dC) и 0,20 ± 0,01 мкМ (dG), соответственно, что все ниже, чем значения BF [0,95 ± 0,07 (dA), 0,20 ± 0,01 (dT), 1,50 ± 0,02 (dC) и 0,54 ± 0,01 мкМ (dG), соответственно]. Среди всех четырех 3’-Aep-dNTP BF демонстрирует сильное предпочтение 3’-Aep-dTTP и эффективно включает этот нуклеотид. Напротив, 3’-Aep-dCTP — наименее эффективный нуклеотид, используемый BF для репликации ДНК. Хотя KF также демонстрирует более высокую активность включения с 3’-Aep-dTTP, у него меньше смещения для трех других 3’Aep-dNTP (Таблица 2).

Таблица 2 Установившаяся постоянная Михаэлиса ( K m ) 3’-Aep-dNTP для BF и KF.

Правильное включение 3′-Aep-dNMPs с помощью BF и KF

Чтобы приспособиться к 3′-Aep-dCTP, наше моделирование предполагает, что BF должен адаптировать альтернативную конформацию в нуклеотид-связывающем кармане (NBP), в основном сахарный стерический вентиль E658 и О-спираль субдомена пальца (рис. 2С). Незначительные структурные сдвиги могут изменять геометрию активного сайта в закрытой конформации тройного комплекса BF и влиять на его нуклеотидную (NT) селективность 33 .Чтобы оценить, могут ли структурные изменения, вызванные 3’-Aep-dNTP, изменить выбор правильного и неправильного NT с помощью BF во время репликации ДНК, были выполнены анализы удлинения праймера с последующим анализом фрагментов ДНК. Как показано на фиг. 4, BF селективно включал соответствующий комплементарный нуклеотид (праймер + dNMP) напротив шаблонного основания. Сходные результаты были получены, когда 1 мМ концентрация каждого 3′-Aep-dNTP (примерно в 1000 раз выше, чем значения K m каждого нуклеотида) были использованы в тех же условиях реакции (данные не показаны). .Аналогичным образом, когда KF тестировали в тех же экспериментальных условиях, правильный комплементарный 3’-Aep-dNMP был избирательно включен в ДНК (фигура S3). Следовательно, и BF, и KF поддерживают хорошую селективность NT к 3’-Aep-dNTP во время репликации ДНК.

Рисунок 4

Избирательность правильного стиха неправильного 3’-Aep-dNTP (Oligo_T # 1 ~ 4) от BF. Каждая реакция содержит 3 нМ праймера ДНК (Oligo_P # 1), 1 мкМ 3’-Aep-dNTP и 0,5 ед. BF. Анализ выполняли при 60 ° C в течение 5 минут, как описано в разделе «Методы».Указаны праймер (N) и праймер плюс включенный 3’-Aep-dNMP посредством BF (N + 1).

3′-этерифицированная группа 3′-Aep-dNMP редактируется во время включения нуклеотида с помощью BF

Две ДНК-полимеразы A-семейства (AF-DNAP), 3 ‘→ 5′ экзонуклеаза-дефицитный Т7 (секвеназа) и Taq, как ранее было показано, продуктивно используют различные 3’-этерифицированные dNTP для репликации ДНК 25,26,29 . Однако не каждая модификация 3’-этерифицированных нуклеотидов может предотвратить дальнейшее удлинение растущей цепи ДНК за счет AF-DNAP.Объемный 2’-дезоксил-3’-антранилоил-dNTP действует как терминатор цепи ДНК, когда он включен в ДНК с помощью Taq 25,29 . Напротив, включенный 3’-O-ацилированный dNMP не может полностью блокировать удлинение ДНК тем же ферментом (Taq), потому что 3’-O-ацилированная группа NT удаляется во время репликации ДНК 26 . Таким образом, мы хотели бы изучить, остается ли (2-аминоэтокси) -3-пропионильная группа 3’-Aep-dNMP нетронутой после того, как она включена в зарождающуюся цепь ДНК с помощью BF.Реакции включения однонуклеотидов с помощью BF проводили в анализах удлинения праймеров с использованием либо природного dNTP, либо 3’-Aep-dNTP. Затем продукты реакции применяли для анализа методом матричной лазерной десорбции / ионизации-времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS), как описано в Методиках. Определяли молекулярную массу и идентичность праймера (N) или праймера плюс добавленный нуклеотид (N + 1). Как показано на фиг.5, продукты реакции удлинения праймера с природным dNTP (, левая панель, ) или 3′-Aep-dNTP (, правая панель, ) показывают идентичную, соответствующую массу для обоих праймеров (m / z 7 474) и праймер плюс добавление dAMP (m / z 7 787), dTMP (m / z 7 778), dCMP (m / z 7 762) или dGMP (m / z 7 803) соответственно.Эти результаты показывают, что (2-аминоэтокси) -3-пропионильная группа 3’-Aep-dNMP была гидролизована обратно до нормального 3’-OH после того, как она была включена в растущую цепь ДНК с помощью BF.

Фиг. 5

Анализ включенного 3’-Aep-dNMP с помощью BF с использованием масс-спектрометрии MALDI-TOF. Каждая реакционная смесь содержит 0,2 мкМ ДНК-праймера (Oligo_P # 2), 10 мкМ dNTP или 20 мкМ 3’-Aep-dNTP и 1 ед. BF. Каждую реакцию проводили при 60 ° C в течение 15 минут, как описано в Методах. Масса праймера (N) и праймера плюс внедренный dNMP или 3’-Aep-dNMP с помощью BF (N + 1) были помечены рядом с соответствующими пиками, соответственно.

Ферментно-опосредованное снятие защиты 3′-Aep-dNMP позволяет включать множественные нуклеотиды с помощью BF в гомополимерные ДНК-матрицы

3′-замещенная группа 3′-Aep-dNTP стабильна в присутствии или отсутствии BF в условиях условия анализа (Рисунок S4). Кроме того, инактивированный нагреванием BF теряет активность как полимеризации ДНК, так и активности 3’-эстеразы (Рисунок S5). Следовательно, вполне вероятно, что (2-аминоэтокси) -3-пропионильная группа 3’-Aep-dNTP модифицируется и восстанавливается обратно до обычного 3’-OH под действием BF во время репликации ДНК.В любом случае после каждого раунда включения 3’-Aep-dNMP с помощью BF 3’-конец праймера ДНК легко превращается обратно в нормальный 3’-ОН. Следовательно, в реакции удлинения праймера должно происходить множественное включение 3’-Aep-dNMP с помощью BF. Чтобы проверить, будет ли BF последовательно включать несколько 3′-Aep-dNMP во время синтеза ДНК, были проведены анализы удлинения праймеров с использованием либо гомополимерной dA-, dT-, dC- или dG-матрицы ДНК в присутствии соответствующего, соответствовал 3′-Aep-dNTP, соответственно.Матрица ДНК содержит двенадцать повторений последовательности dA, dT, dC или dG (dN 12 ), как показано на фиг. 6A. Продукты реакции после каждого добавления 3′-Aep-dNTP демонстрируют участок непрерывных удлиненных пиков ДНК, которые представляют последовательные включения 3′-Aep-dNMP с помощью BF в диапазоне от 1 до 12-NT вставок на соответствующей гомополимерной ДНК-матрице (рис. . 6B). В условиях стационарной реакции расстояние удлиненных фрагментов ДНК или пиков от исходного положения праймера зависит от времени.Чем больше время реакции, тем дальше миграция протяженных пиков ДНК (рис. 6D). Более того, общее время, необходимое BF для репликации в области с двенадцатью NT-повторами (dN 12 ), зависит от концентраций 3’-Aep-dNTP в реакции. Более высокая концентрация 3’-Aep-dNTP в реакции вызывает более быстрое удлинение ДНК за счет BF через гомополимерную матрицу ДНК (фиг. 6C).

Фиг. 6

Множественные включения 3’-Aep-dNTP под действием BF на гомополимерную ДНК-матрицу.( A ) Схематическое изображение реакции удлинения праймера через гомополимерную ДНК-матрицу под действием BF в присутствии согласованного 3’-Aep-dNTP (10 мкМ). ( B ) Непрерывное включение 3’-Aep-dNMP посредством BF в соответствующую гомополимерную ДНК-матрицу (Oligo_T # 9 ~ 12). ( C ) Скорость удлинения праймера BF на гомополимерной матрице dA 12 (Oligo_T # 9) в присутствии 25, 50, 75, 100, 150, 175 и 200 мкМ 3′-Aep- dTTP. Скорость удлинения праймера при каждой концентрации нуклеотидов рассчитывали, как описано в Методиках.( D ) Динамика множественных включений 3’-Aep-dTMP посредством BF через гомополимерную матрицу dA 12 в присутствии 10 мкМ 3’-Aep-dTTP. ( E ) Результаты включения 3’-Aep-dTMP с последующим преследованием 10 мкМ dTTP или 3’-Aep-dTTP в течение 1 мин.

Затем мы проверили, может ли ДНК-праймер с включенным 3’-Aep-dNMP быть легко удлинен нормальным dNTP на гомополимерной матрице dN 12 -ДНК. Анализы удлинения праймера проводили поэтапно, сначала добавляя 3’-Aep-dNTP в реакцию с последующим добавлением родственного, природного dNTP или того же 3’-Aep-dNTP.Как показано на фиг. 6E, ДНК-праймер быстро удлинялся через гомополимерный dA 12 -шаблон с помощью BF сразу после преследования с нормальным dTTP. Напротив, дополнительное добавление 3’-Aep-dTTP в реакцию не влияло на скорость удлинения праймера с помощью BF. Эти результаты подтверждают, что 3’-замещенная группа 3’-Aep-dNMP снова меняется на bona fide 3’-OH после того, как она добавляется в растущую цепь ДНК.

Расщепление 3′-защитной группы встроенного 3′-Aep-dNMP с помощью BF от конца 3′-праймера делает возможным длительный непрерывный синтез ДНК

Поскольку модификация 3′-сложным эфиром 3′-Aep- dNMP одновременно удаляется с 3′-конца растущей цепи ДНК после каждого цикла добавления NT с помощью BF, это должно обеспечивать непрерывную репликацию ДНК.Чтобы дополнительно проверить, будет ли BF использовать все четыре 3′-Aep-dNTP для длительного непрерывного синтеза ДНК, были проведены анализы удлинения праймера с использованием праймера ДНК (P), меченного флуоресцеином (FAM), предварительно отожженного 100 ДНК-матрица длиной нуклеотид в присутствии всех четырех dNTP или 3′-Aep-dNTP (фиг. 7A). Как показано на фиг. 7B, зависящее от времени удлинение ДНК под действием BF наблюдалось после добавления либо dNTP, либо 3′-Aep-dNTP, в то время как единственный пик ДНК-праймера (P) наблюдался в отрицательном контроле (NC ) реакция в отсутствие нуклеотидов ( Верхняя панель ).Удлиненные продукты ДНК, генерируемые BF с 3’-Aep-dNTP, показали распределение фрагментов ДНК различных размеров от ~ 75 до 110 нуклеотидов (NT) после 15 минут реакции. С другой стороны, более длинные фрагменты ДНК, от ~ 106 до 144 NT, наблюдались, когда нормальные dNTP присутствовали в тех же экспериментальных условиях. Тем не менее, реакции удлинения праймера с 3’-Aep-dNTP или природными dNTP были завершены в течение часа после реакции. Очевидно, встроенные 3’-Aep-dNMP не препятствуют удлинению ДНК с помощью BF и обеспечивают длительный непрерывный синтез ДНК.

Фиг. 7

Непрерывный синтез ДНК BF с использованием всех четырех 3’-Aep-dNTP. ( A ) Схематическое изображение анализа удлинения ДНК с использованием ДНК бактериофага M13 в качестве матрицы (Oligo_T # 13) вместе со всеми четырьмя dNTP или 3’-Aep-dNTP. ( B ) Динамика удлинения ДНК под действием BF с 20 мкМ dNTP или 3’-Aep-dNTP, соответственно, в реакции. ( C ) Метод определения ошибок замещения оснований BF в присутствии нормальных dNTP или 3’-Aep-dNTP.( D ) Профиль репликативной ошибки BF в присутствии нормальных dNTP (, левый, ) или 3’-Aep-dNTP (, правый, ). Ожидаемое или правильное основание A, T, C или G, соответственно, указано на оси абсцисс. Фактическое выявленное изменение базы (A, T, C или G) представлено на оси ординат. Ось Z показывает частоту замены правильной базы.

Наконец, мы хотели бы узнать, поддерживает ли использование BF всех четырех 3’-Aep-dNTP хорошую точность репликации ДНК.Чтобы определить профили ошибок синтеза ДНК с помощью BF, праймеры ДНК, содержащие уникальные метки последовательности ДНК на 5’-конце, использовали в реакциях удлинения праймера, как показано на фиг. 7C. Продукты удлиненной ДНК дополнительно амплифицировали с помощью ПЦР, клонировали в вектор для клонирования ТА и трансформировали в клетки E. coli . Рекомбинантные векторы, несущие фрагменты ДНК репликации BF, были выделены из отдельных бактериальных колоний и затем секвенированы. Были проанализированы ошибки замещения оснований при репликации ДНК с помощью BF.Как показано на фиг. 7D, общая репликативная точность BF в присутствии 3’-Aep-dNTPs эквивалентна значениям природных dNTP. Однако реакция синтеза ДНК с 3′-Aep-dNTP показывает небольшое повышение переходных мутаций C → T и G → A до 2,6 × 10 -4 и 2,6 × 10 -4 ошибок на основание, соответственно, выше фоновое значение. Интересно, что частота переходных мутаций A → G в реакции 3’-Aep-dNTPs была ниже, чем в реакции естественного dNTP.В целом, BF может использовать 3’-Aep-dNTP для точной и непрерывной репликации ДНК.

Измерения энергии диссоциации связи Гомолитическое расщепление

Вот момент, который вызывает большую путаницу.

Посмотрите на эти две реакции. Как вы думаете, какая связь более сильная, O-H или C-H?

Согласно этой таблице (PDF) энергия диссоциации связи (BDE) OH составляет 460 кДж / моль (110 ккал / моль), а значение для CH составляет 389 кДж / моль (93 ккал / моль). [Другой стол см. На этой странице от Reusch].Так почему же здесь разрывается более сильная связь?

Другой пример:

Но здесь прочность связи алкин C-H (523 кДж / моль или 125 ккал / моль) по сравнению с прочностью связи третичного C-H в этом случае (384 кДж / моль или 93 ккал / моль). Итак, , почему образуется связь C-H с более низкой энергией диссоциации связи, а связь C-H с более высокой разрывается?

Вот три подсказки об энергиях диссоциации связи.

1) Для связей C-H энергии диссоциации связи уменьшаются по мере добавления замещения к углероду.

2) Вода может мешать кислотно-основным реакциям, но w ater имеет тенденцию не мешать свободнорадикальным реакциям. Если вы проводили реакцию Гриньяра в лаборатории, вы знаете, насколько они могут быть привередливыми, потому что вам нужно удалить все следы воды из растворителя, чтобы она началась. С другой стороны, такое же ограничение неприменимо к реакциям свободных радикалов! Можно проводить свободнорадикальные реакции в присутствии воды, не беспокоясь о том, что желаемая свободнорадикальная реакция вместо этого будет улавливаться H-OH.

3) Другой ключ к разгадке состоит в том, что гораздо легче образовать алкильные радикалы, чем алкенильные и алкинильные радикалы.

Ответ состоит в том, что энергия диссоциации связи = гомолитический разрыв

Измеренные энергии диссоциации связи (BDE) в таблицах представляют собой разрыв связи на два радикалов . Это из-за способа измерения энергии диссоциации связи — с помощью калориметрии радикальных реакций.

Следовательно, энергия диссоциации связи отражает стабильность образующихся радикалов! R3C • более стабильный радикал, чем HO •.R3C • также является более стабильным радикалом, чем алкинильный радикал. Это также помогает объяснить, почему в порядке прочности связи идет первичный C-H> вторичный C-H> третичный C-H.

PS Почему измеряется сила гомолитической связи , а не гетеролитическая ? Это хороший вопрос. Например, в алканах гораздо легче гомолитически разорвать связи C-H и C-C. Во-вторых, радикалы нейтральны и не переносят с собой оболочку растворителя, как анионы. Таким образом, они менее чувствительны к действию растворителей.Техническое обсуждение смотрите здесь.

PPS Почему радикал ОН может быть менее стабильным, чем радикалы R, а стабильность алкильных радикалов может быть выше, чем стабильность алкенильных и алкинильных радикалов?


(для продвинутых) Ссылки и дополнительная литература

  1. Недостатки в основе энергии радикальной стабилизации на основе энергии диссоциации связи алкильных групп с водородом
    Андреас А. Завицас, Дональд В. Роджерс и Никита Мацунага
    The Journal of Organic Chemistry 2010, 75 (16), 5697-5700
    DOI:
    1021 / jo101127m
    Несколько учебников, в том числе некоторые продвинутые, предоставляют информацию об энергии радикальной стабилизации, и в этой статье обсуждается, почему это может быть не так. лучший способ количественно оценить стабильность свободных радикалов.
  2. О преимуществах энергии стабилизации углеводородных радикалов на основе энергии диссоциации связи R − H
    Мэтью Д. Водрих, У. Чад Макки и Пол фон Раге Шлейер
    The Journal of Organic Chemistry 2011, 76 (8), 2439-2447
    DOI:
    1021 / jo101661c
    В этой статье рассматриваются некоторые недостатки подхода, использованного в ссылке №1 выше. Покойный профессор Шлейер был очень влиятельной фигурой в органической химии и был пионером в использовании вычислительных методов для решения интересных проблем органической химии.
  3. Радикальная энергия стабилизации свободного радикала с замещенным углеродным центром зависит как от функциональности заместителя, так и от порядка радикала
    Марвин Л. Поутсма
    The Journal of Organic Chemistry 2011, 76 (1), 270-276
    DOI:
    1021 / jo102097n
  4. Единая универсальная шкала энергий радикальной стабилизации не существует: глобальные энергии диссоциации связи и радикальная термохимия описываются объединением двух универсальных шкал
    Andreas A .Завицас
    Журнал органической химии 2008 , 73 (22), 9022-9026
    DOI:
    1021 / jo8018768
  5. Энергия диссоциации связи кинетическими методами

    5 А. Керр Обзоры 1966, 66 (5), 465-500
    DOI : 10.1021 / cr60243a001
    В этой статье описываются экспериментальные методы измерения гомолитических БДЭ.
  6. III — Энергии связи
    Сидни В.Benson
    Journal of Chemical Education 1965, 42 (9), 502
    DOI : 10.1021 / ed042p502
    В этой статье описываются эмпирические измерения энергий гомолитической диссоциации связи. Этот документ был написан профессором Бенсоном, когда он работал в Стэнфордском исследовательском институте (ныне SRI International), некоммерческом исследовательском центре, очень близком к Стэнфордскому университету. В 1978 году профессор Бенсон присоединился к профессору Джорджу Олаху в USC и помог основать там Локерский научно-исследовательский институт углеводородов.
  7. От равновесной кислотности к энергии радикальной стабилизации
    Фредерик Г. Бордвелл и Сиань Ман Чжан
    Отчет о химических исследованиях 1993, 26 (9), 510-517
    DOI : 10.1021 / ar00033a009
    В этой статье делается попытка сопоставить кислотность протона с БДЭ соответствующей связи CH или XH.
  8. Ab Initio Расчеты относительных энергий резонансной стабилизации аллильных и бензильных радикалов
    David A.Хроват и Вестон Тэтчер Борден
    The Journal of Physical Chemistry 1994, 98 (41), 10460-10464
    DOI:
    1021 / j100092a014
    Энергия стабилизации винильной группы (в аллильном радикале ) и фенильная группа (в бензильном радикале), согласно расчетам, составляют 15,7 ккал / моль и 12,5 ккал / моль соответственно.
  9. Влияние соседних акцепторов и доноров на стабильность углерод-центрированных радикалов
    G.Бордвелл, Сяньман Чжан и Михаил С. Альнаджар
    Журнал Американского химического общества 1992 , 114 (20), 7623-7629
    DOI:
    10.1021 / ja00046a003
    Таблица I в этой статье содержит энергии стабилизации метильных радикалов с различными заместителями (например, · CH 2 X).

Отщепление OH от тирозина: развенчание мифа — ORA

Библиографические данные (информация, относящаяся к результатам исследований) и полнотекстовые элементы (например,грамм. статьи, тезисы, отчеты и т. д.) поступают в ORA из нескольких разных источников. К сожалению, мы не можем предоставить полные тексты для всех результатов исследования.

Пожалуйста, свяжитесь с командой ORA (), если у вас есть вопросы относительно недоступного контента, ИЛИ если вам известно о полнотекстовой копии, которую мы можем предоставить.
Контент может быть недоступен по следующим четырем причинам
  • Версия неподходящая
      Мы не получили подходящего полного текста для данного исследования.См. Эту страницу для получения дополнительной информации.
  • Недавно завершено
      Иногда контент хранится в ORA, но недоступен в течение определенного периода времени в соответствии с политикой и пожеланиями правообладателей.
  • Разрешения
      Весь контент, доступный в ORA, должен соответствовать соответствующим правам, таким как авторское право.См. Эту страницу для получения дополнительной информации.
  • Оформление
      Некоторые тома диссертаций, отсканированные в рамках схемы оцифровки, финансируемой доктором Леонардом Полонски, в настоящее время недоступны из-за конфиденциальных материалов или неурегулированных сторонних авторских прав. Мы пытаемся связаться с авторами, чьи тезисы затронуты.
Альтернативный доступ к полному тексту

Вы можете получить доступ к полному тексту непосредственно с веб-сайта издателя, используя ссылку «Копия издателя» в поле «Ссылки и загрузки» на странице результатов исследования ORA.Для этого метода может потребоваться институциональная или индивидуальная подписка на журнал / ресурс.

Расщепление и снятие защиты смолой

Fmoc

Считается, что фенол обеспечивает некоторую защиту остаткам Tyr и Trp 1 . Было показано, что триалкилсиланы, такие как TIS и TES, являются эффективными заменителями EDT 12 без запаха, особенно пептидов, содержащих Arg (Pmc) и Trp (Boc) 5, 8 . Эти реагенты также очень эффективны при гашении высокостабилизированных катионов, высвобождающихся при расщеплении Trt 12 , Tmob 13, и линкера амида Ринка, и поэтому их использование настоятельно рекомендуется, когда присутствуют эти фрагменты.

Когда в пептиде присутствует несколько менее неустойчивых к кислотам защитных групп или пептид является длинным и, следовательно, содержит множество защитных групп, время расщепления обычно необходимо значительно увеличить. Группа Mtr менее неустойчива к кислотам, чем группы PMC или Pbf, и ее полное удаление может занять до 24 часов. В таких случаях, когда Trp присутствует с несколькими защитными группами Mtr, чрезвычайно полезно иметь возможность оптимизировать условия расщепления путем мониторинга удаления этой защитной группы с помощью ВЭЖХ.Необходимо найти компромисс между частично модифицированным триптофаном пептидом и неполным снятием защиты с Arg (Mtr). Следовательно, с пептидами, содержащими Trp, настоятельно рекомендуется использовать производные Trp (Boc), чтобы избежать модификации боковой цепи триптофана.

Для длинных пептидов может потребоваться увеличенное время расщепления, чтобы полностью удалить всю защиту боковой цепи. Если полное снятие защиты не достигается в течение 6 часов, пептид следует осадить эфиром и повторить расщепление со свежими реагентами.Чтобы найти оптимальный режим расщепления, необходимо провести тестовые расщепления. Неполное снятие защиты с боковой цепи часто упускают из виду как причину сбоя в синтезе длинных пептидов.

Наблюдались проблемы с медленным снятием защиты с N -концевых остатков Asn (Trt). Их можно легко преодолеть, увеличив время расщепления до 4 часов или используя Asn (Dmcp) вместо Asn (Trt).

Метод 2: Общее расщепление TFA

ВНИМАНИЕ: TFA — чрезвычайно коррозионная жидкость; При использовании этого реагента необходимо соблюдать большую осторожность.Надлежащие средства защиты глаз, лабораторный халат и перчатки являются обязательными. Соблюдайте местные, государственные / провинциальные и федеральные правила техники безопасности. Используйте в эффективном вытяжном шкафу.

  1. Поместите сухую смолу в колбу и добавьте раствор TFA, содержащий соответствующие поглотители (10-25 мл / г смолы, рис. 1). ПРИМЕЧАНИЕ: необходимо произвести расчет, чтобы обеспечить наличие достаточного количества поглотителя для качества пептида и присутствующих защитных групп. Закройте колбу и дайте ей постоять при комнатной температуре, время от времени взбалтывая. Время реакции зависит от последовательности (см. «Мониторинг реакции расщепления» ниже).
  2. Удалите смолу фильтрованием при пониженном давлении. Дважды промойте смолу TFA. Объединить фильтраты и добавить (по каплям) 8-10-кратный объем холодного эфира. Иногда необходимо выпарить большую часть TFA, чтобы добиться хорошего осаждения сырого пептида. Для дальнейшего облегчения осаждения эфир можно охладить льдом.
  3. Выделите пептид, как описано в Method 16 .

Метод 3: Двухэтапная процедура отделения / снятия защиты амидной смолы Ринка

  1. Развести смолу в 10% TFA в DCM и вылить ее в стеклянную воронку с мелким агломератом.
  2. Позвольте растворителю медленно просочиться через слой смолы. Промойте смолу 5% TFA, позволяя ей медленно проходить через слой смолы. Отделение представляет собой равновесие, катализируемое кислотой, поэтому важно постоянно удалять отделившийся пептид с помощью этого проточного метода. Проведение реакции в колбе не приведет к полному отслоению. Выходы могут быть улучшены добавлением 1-5% TIS к смеси для расщепления.
  3. Удалите избыток TFA / DCM при пониженном давлении и завершите снятие защиты с помощью 95% TFA плюс поглотители в соответствии с аминокислотным составом (см. Рисунок 1 ).

Контроль реакции расщепления

Присутствие Mtr-защищенного аргинина в пептиде требует длительного времени реакции, варьирующегося от 3 до 6 часов, в зависимости от выбора используемых поглотителей ( Рисунок 1 ). Множественные остатки аргинина могут потребовать увеличения времени реакции до 24 часов. В таких случаях чрезвычайно полезно иметь возможность оптимизировать условия расщепления путем мониторинга удаления этой защитной группы с помощью ВЭЖХ.

Общие протоколы с участием сильных кислот

В качестве альтернативы TFA для быстрого снятия защиты с менее неустойчивых к кислотам защитных групп боковых цепей, таких как Arg (Mtr / Pmc / Pbf), Asn (Mbh) и Gln (Mbh), можно использовать более сильные кислоты с соответствующими поглотителями. без сообщения о побочных реакциях.

Расщепление смолы с использованием триметилсилилбромида

14

Длительное время расщепления, которое часто считается необходимым для полного снятия защиты с пептидсодержащих множественных остатков Arg (Mtr), может привести к серьезному ухудшению качества продукта. В частности, длительное воздействие EDT в TFA на пептиды, содержащие триптофан, может привести к модификации остатков триптофана из-за образования дитиокета. Расщепление триметилсилилбромидом (TMSBr) устраняет эти проблемы, поскольку было показано, что этот реагент полностью снимает защиту до 4 остатков Arg (Mtr) за 15 минут.Кроме того, было обнаружено, что этот метод полностью подавляет образование побочных продуктов сульфирования, даже когда используется незащищенный триптофан. 15 .

Метод 4: Расщепление с помощью TMSBr

  1. Добавить TMSBr (1,32 мл) к раствору EDT (0,50 мл), м-крезола (0,1 мл) и тиоанизола (1,17 мл) в TFA (7,5 мл), охлажденному до 0 ° C. Добавляют пептидную смолу (200 мг) и дают смеси постоять в течение 15 мин под слоем N 2 при 0 ° C.
  2. Удалите смолу фильтрованием при пониженном давлении.Дважды промойте смолу чистой TFA. Объединить фильтраты и добавить (по каплям) 8-10-кратный объем холодного эфира. Иногда необходимо выпарить большую часть TFA, чтобы добиться хорошего осаждения сырого пептида. Для дальнейшего облегчения осаждения эфир можно охладить льдом.
  3. Выделите пептид, как описано в Method 16 .

ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда требуется дополнительная обработка пептида фторидом аммония, чтобы обратить вспять любое силилирование, которое могло произойти.

Отщепление от очень чувствительных к кислоте смол

Смола Rink Acid 16 , 2-хлортритил 17 , HMPB 18 , NovaSyn TGT 19, и смолы Sieber 20 содержат линкеры с высокой кислоточувствительностью и подходят для синтеза защищенных пептидов.

Смолы HMPB и амидные смолы Sieber

Полностью защищенные пептидные кислоты могут быть получены из линкера HMPB 21 и защищенные амиды из амидной смолы Зибера 20 .Однако необходимо тщательное экспериментирование, если необходимо избежать преждевременной потери защитных групп боковых цепей. Повторная обработка пептидиловой смолы 1% -ным раствором ТФУ в дихлорметане в тандеме с минимальным временем реакции даст наилучшие результаты.

В идеале, расщепление следует проводить в герметичной воронке из спеченного стекла, чтобы предотвратить испарение легколетучих DCM, а фильтрацию следует проводить под давлением азота, а не с использованием вакуума.

Если пептид содержит Met или Trp, к смеси для расщепления следует добавить 1% EDT, чтобы предотвратить повторное присоединение пептида. Если пептид содержит C-концевой остаток Trp, настоятельно рекомендуется использовать Trp (Boc). 21 .

В этой периодической процедуре сила кислоты увеличивается ступенчато, что определяется количеством присутствующих TFA-буферных групп. Максимальная концентрация пептида может содержаться в первой или в одной из последующих промывок, в зависимости от буферной способности амидных связей и других присутствующих функциональных групп.Защитные группы боковых цепей бутильного типа t- , а также Trt (на Asn и Gln) остаются полностью неповрежденными во время этого процесса 21 .

Метод 5: Расщепление разбавленной TFA

  1. Предварительно набухают сухую смолу (1 г) с DCM в герметичной воронке из спеченного стекла и удаляют избыток DCM.
  2. Добавить 1% TFA в сухой DCM (10 мл), закрыть воронку и встряхивать в течение 2 мин. Раствор фильтруют, подавая давление азота в колбу, содержащую 10% пиридин в метаноле (2 мл).
  3. Повторить шаг 2 до 10 раз, отмыть остаточный защищенный пептид от смолы 3 х 30 мл ДХМ, 3 х 30 мл МеОН, 2 х 30 мл ДХМ, 3 х 30 мл МеОН и проверить фильтраты с помощью ТСХ или ВЭЖХ.
  4. Объединяют фильтраты, содержащие продукт, и упаривают при пониженном давлении до 5% объема. К остатку добавляют воду (40 мл) и охлаждают смесь льдом, чтобы ускорить осаждение продукта.
  5. Продукт выделяют фильтрованием через воронку из пористого стекла. Промыть изделие трижды пресной водой.Сушите образец в эксикаторе под вакуумом над КОН, а затем над P 2 O 5 .

2-хлортритил, смолы NovaSyn

® TGT и NovaPEG Trt Смолы

2-хлортритил 17 , NovaSyn ® TGT 19 и NovaPEG Trt могут быть расщеплены 1% TFA, как описано выше, или в более мягких условиях с AcOH или TFE 22 для получения защищенных пептидов. При получении защищенных пептидов использование Fmoc-His (Clt) -OH особенно рекомендуется для введения гистидина.Это помогает избежать частичного снятия защиты с боковой цепи гистидина, которое может происходить при использовании His (Trt).

Метод 6: Расщепление с помощью TFE / DCM

1. Обработайте пептидиловую смолу при комнатной температуре смесью TFE / DCM (2: 8) в течение 3 x 1 час.

2. По истечении соответствующего времени удалите смолу фильтрованием, промойте 3 раза смесью для расщепления.

3. Выпарить раствор досуха и осадить защищенный пептид эфиром.

Отделенный, полностью защищенный пептид будет очень гидрофобным, и может потребоваться дальнейшая экстракция из смолы с помощью ДМФА, ДМСО.Полноту расщепления можно проверить с помощью ТСХ фильтрата. Очищают хроматографией низкого давления на силикагеле, ВЭЖХ на фенилоксиде кремния или перекристаллизацией.

Пептиды, присоединенные линкером HMBA и оксимом

Для синтеза пептидных карбоксамидов линкер HMBA в значительной степени заменен линкером типа амида Ринка. Тем не менее, этот линкер по-прежнему является одним из самых гибких линкеров пептид-смола. Пептиды могут высвобождаться из линкера с множеством различных нуклеофилов, давая пептиды с множеством функциональных групп на С-конце 3, 22-25 (, таблица 2, ).Эти протоколы также совместимы с оксимным линкером, используемым в Boc SPPS.

Масс-спектрометрия — образцы фрагментации

Ниже приведены примеры соединений, перечисленных по функциональным группам, которые демонстрируют закономерности, которые можно увидеть в масс-спектрах соединений, ионизированных ионизацией электронным ударом. Эти примеры не предоставляют информации о механизмах фрагментации, которые вызывают эти шаблоны. Дополнительную информацию можно найти в справочниках по масс-спектрометрии.

Спирт

Молекулярный ион спирта мал или отсутствует. Обычно происходит разрыв связи C-C рядом с кислородом. Потеря H 2 O может произойти, как показано на спектрах ниже.

3-пентанол (C 5 H 12 O) с MW = 88,15

Альдегид

Разрыв связей рядом с карбоксильной группой приводит к потере водорода (молекулярный ион меньше 1) или потере CHO (молекулярный ион меньше 29).

3-фенил-2-пропеналь (C 9 H 8 O) с молекулярной массой 132,16

Алкан

Присутствуют пики молекулярных ионов, возможно, с низкой интенсивностью. Картина фрагментации содержит кластеры пиков, разнесенных на 14 единиц массы (которые представляют потерю (Ch3) nCh4).

Гексан (C6h24) с молекулярной массой 86.18

Амид

Первичные амиды показывают пик основания из-за перегруппировки Маклафферти.

3-метилбутирамид (C 5 H 11 NO) с MW = 101,15

Амин

Пик молекулярного иона — нечетное число.Альфа-расщепление преобладает над алифатическими аминами.

н-Бутиламин (C4h21N) с молекулярной массой 73,13

Другой пример — вторичный амин, показанный ниже. Опять же, пик молекулярного иона — нечетное число. Основной пик происходит от разрыва C-C, прилегающего к связи C-N.

н-Метилбензиламин (C 8 H 11 N) с MW = 121.18

ароматический

Пики молекулярных ионов сильные благодаря стабильной структуре.

Нафталин (C 10 H 8 ) с MW = 128,17

Карбоновая кислота

В короткоцепочечных кислотах пики из-за потери ОН (молекулярный ион меньше 17) и COOH (молекулярный ион меньше 45) заметны из-за разрыва связей рядом с С = О.

2-бутеновая кислота (C 4 H 6 O 2 ) с MW = 86,09

Сложный эфир

Фрагменты появляются из-за разрыва связи рядом с C = O (потеря алкоксигруппы, -OR) и перегруппировки водорода.

Этилацетат (C 4 H 8 O 2 ) с MW = 88.11

эфир

Фрагментация имеет тенденцию происходить альфа по отношению к атому кислорода (связь C-C рядом с кислородом).

Этилметиловый эфир (C 3 H 8 O) с молекулярной массой 60,10

Галогенид

Присутствие атомов хлора или брома обычно определяется по изотопным пикам.

1-Бромпропан (C 3 H 7 Br) с MW = 123,00

Кетон

Основные пики фрагментации возникают в результате разрыва связей C-C, прилегающих к карбонилу.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

2019 © Все права защищены. Карта сайта